本發(fā)明公開了一種堿性蛋白酶基因、雜合啟動子、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)工程菌、堿性蛋白酶及方法和應(yīng)用，堿性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的堿性蛋白酶基因bcp，其全長為1143bp，在枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株中進(jìn)行高效表達(dá)，從而降低堿性蛋白酶BCP的生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別地，涉及一種堿性蛋白酶基因。此外，本發(fā)明還涉及雜合啟動子、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)工程菌及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)形成多肽以及游離氨基酸，在許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。蛋白酶來源廣泛，目前產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的蛋白酶主要來源于微生物，微生物來源蛋白酶具有種類多、酶學(xué)特性多樣等特點(diǎn)。微生物來源的蛋白酶，根據(jù)作用pH可以分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶。這三種蛋白酶根據(jù)各自不同的酶學(xué)性質(zhì)分別應(yīng)用于不同的工業(yè)領(lǐng)域。其中堿性蛋白酶作為一種絲氨酸蛋白酶，具有良好的活性和穩(wěn)定性，能夠有效分解各種蛋白質(zhì)，目前主要應(yīng)用于食品加工、洗滌以及飼料等領(lǐng)域。堿性蛋白酶作為一種常用的工業(yè)酶制劑，市場上主流的堿性蛋白酶產(chǎn)品則是來源于嗜堿芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌。堿性蛋白酶的生產(chǎn)方式則主要分為天然菌發(fā)酵培養(yǎng)和異源高效表達(dá)兩大類。天然菌發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵周期短，缺點(diǎn)則是酶活低、發(fā)酵過程不穩(wěn)定及培養(yǎng)基組成復(fù)雜、菌種容易退化等。相對于天然菌，異源重組表達(dá)具備發(fā)酵酶活高、發(fā)酵過程穩(wěn)定可控等優(yōu)點(diǎn)，因此其成為主流的生產(chǎn)方式。目前堿性蛋白酶異源表達(dá)宿主包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，其中枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主的研究最多。枯草芽孢桿菌作為一種食品級表達(dá)宿主具有遺傳操作簡單、基因背景清晰、胞外分泌蛋白等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種堿性蛋白酶基因、雜合啟動子、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)工程菌、堿性蛋白酶及方法和應(yīng)用，以解決來源于芽孢桿菌的堿性蛋白酶的生產(chǎn)成本高、堿性蛋白酶發(fā)酵活力低的技術(shù)問題。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種堿性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通過同源克隆獲得環(huán)狀芽孢桿菌堿性蛋白酶基因bcp。參照細(xì)菌基因組提取試劑盒提取環(huán)狀芽孢桿菌基因組sy1(環(huán)狀芽孢桿菌sy1由實(shí)驗(yàn)室前期從豆渣里面篩選獲得)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫Bacillus circulans strain NCTC2610基因組序列(GenBank:UAPZ01000012.1：120935-122077)設(shè)計一對引物，即正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示(bc1-fw，5'–TCACGGCCG ATGAAGAAACTGTTGACGAAA-3'，下劃線為Ec52I酶切位點(diǎn))，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示(bc1-rev：5'-ACGTCTAGAGCGTGTTGCCGCTTCTGC-3'，下劃線為XbaI酶切位點(diǎn))。以提取的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得堿性蛋白酶基因bcp。

上述堿性蛋白酶基因bcp為環(huán)狀芽孢桿菌堿性蛋白酶基因bcp，其全長為1143bp，編碼性蛋白酶BCP的380個氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種堿性蛋白酶BCP，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。通過分析，基因bcp編碼的堿性蛋白酶BCP可以分成三段，前27個氨基酸為其信號肽序列，28位氨基酸到111位氨基酸為其前導(dǎo)肽，112位氨基酸到269位氨基酸為其成熟肽(請確認(rèn)，此處是否需要修改)。