本發明公開了一種全細胞催化L?精氨酸合成反式?4?羥基?L?脯氨酸的方法，屬于生物工程領域。本發明在大腸桿菌中表達了精氨酸羥化酶、精氨酸酶以及鳥氨酸環化脫氨酶，能夠以L?精氨酸為底物生產trans?4?Hyp的重組大腸桿菌，為微生物發酵生產Hyp提供了新的途徑及生產思路。本發明提供的這種微生物全細胞生產Hyp的方法，具有反應條件溫和、原工藝簡單、易于控制等優點，同時有利于環境保護，易于推廣應用。

技術領域

本發明涉及一種全細胞催化L-精氨酸合成反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hyp)是重要的一種氨基酸，是膠原蛋白的主要成分。它通過允許膠原蛋白螺旋與脯氨酸的急劇扭曲而起到膠原穩定性的關鍵作用。Hyp可以通過幾種脯氨酰羥化酶使氨基酸脯氨酸羥基化產生，從而產生不同的羥脯氨酸。其中最重要的是Hyp，它也是膠原蛋白中最豐富的成分。Hyp已廣泛應用于生物化學，食品，化妝品等領域。在微生物中Hyp也涉及在放線菌素，棘白菌素，宜他霉素和紐莫康定等次級代謝物質合成。此外，Hyp的衍生物之一N-乙酰基反式-4-羥基脯氨酸，作為促進骨關節炎治療的炎癥抑制劑。

利用微生物法生產Hyp原對環境污染小，隨著微生物資源的開發和各種合成生物學技術的迅速發展，微生物法生產trans-4-Hyp具有良好的應用前景。但是目前的微生物法生產trans-4-Hyp的方法還較少，催化生產的過程大多繁瑣、消耗大量資源。

發明內容

本發明鑒于現有技術中存在的微生物轉化生產trans-4-Hyp的方法較少、催化過程繁瑣等問題，在傳統的生產trans-4-Hyp的方法的基礎上，改變了之前的由脯氨酸羥化酶對L-脯氨酸進行羥化，本發明利用“提前羥化”策略，以L-精氨酸為前體，先將其羥化為4-羥基-L-精氨酸，后在精氨酸酶及鳥氨酸環化脫氨酶的級聯催化下生成trans-4-Hyp，為微生物發酵生產Hyp提供了新的途徑及生產思路。

本發明提供了鳥氨酸環化脫氨酶突變體，所述突變體以NCBI登錄號為WP_010954390所示的氨基酸為親本，將親本的第162位和/或第205位氨基酸位氨基酸突變。

在一種實施方式中，編碼所述鳥氨酸環化脫氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示

在一種實施方式中，所述突變體為(a)～(c)所示任一：

(a)將親本第162位的蘇氨酸突變為丙氨酸，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；

(b)將親本第205位的賴氨酸突變為甘氨酸，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

(c)將親本第162位的蘇氨酸突變為丙氨酸，同時將第205位的賴氨酸突變為甘氨酸，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本發明提供了編碼所述突變體的基因。

本發明提供了攜帶所述基因的載體。

在一種實施方式中，所述載體以pET28a或pACYCDuet-1為出發載體。

本發明提供了攜帶所述基因的微生物細胞。

本發明提供了一種生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，以同時表達L-精氨酸羥化酶、L-精氨酸酶及所述突變體的重組菌發酵生產反式-4-羥基-L-脯氨酸。

在一種實施方式中，編碼所述L-精氨酸羥化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一種實施方式中，所述L-精氨酸酶來源于Bacillus amyloliquefaciens，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。