本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高活性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的制備方法，包括：步驟一、將經(jīng)過(guò)膠原酶、DNA酶和透明質(zhì)酶處理后的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞消化液進(jìn)行密度梯度離心；將原代腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞接種至完全RPMI培養(yǎng)基中擴(kuò)增；將一代腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞接種至轉(zhuǎn)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，即得高活性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)中高活性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞制備手段繁瑣、產(chǎn)率低的問(wèn)題。上述制備方法中，在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞消化液的制備過(guò)程中采用“綜合酶消化法”消化組織或細(xì)胞富集物，綜合酶消化可以確保的單個(gè)細(xì)胞最佳獲取率。上述制備方法可以用于臨床腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的制備，可以獲得足夠數(shù)量的淋巴細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高活性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL/TILs)是指在腫瘤組織中分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞，具有異質(zhì)性，主要為CD3⁺T細(xì)胞，也包括CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞。目前的研究表明，腫瘤組織中TILs數(shù)量與預(yù)后具有相關(guān)性。同時(shí)，TILs細(xì)胞中那部分能夠特異識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，在體外經(jīng)過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)后，如果回輸?shù)襟w內(nèi)，能夠殺滅腫瘤細(xì)胞，因此具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和抑制轉(zhuǎn)移的作用。這種治療腫瘤的方法稱為T(mén)ILs治療法，屬于過(guò)繼性腫瘤治療中的一種方法。

1986年Rosenberg從荷瘤小鼠腫瘤內(nèi)分離得到TILs細(xì)胞。TILs細(xì)胞表型具有異質(zhì)性，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，但主要為CD3⁺T細(xì)胞，而CD3⁺T細(xì)胞可進(jìn)一步分化成為CD8⁺的細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)、記憶性T細(xì)胞(Tm)、輔助性T細(xì)胞(Th)。不同病人來(lái)源或不同組織來(lái)源的TILs細(xì)胞中各種細(xì)胞類型存在明顯差異。

目前研究發(fā)現(xiàn)，TILs細(xì)胞數(shù)量與病人的預(yù)后間存在相關(guān)性，在腫瘤組織內(nèi)TILs高者預(yù)后更好。已知在TILs內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中被認(rèn)為具有抗腫瘤功能。目前研究也證明TILs內(nèi)存在可以識(shí)別腫瘤新生抗原、突變基因等的TCR(T細(xì)胞抗原受體，T cellreceptor)，具有特異殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。因此，利用TILs抑制腫瘤或抑制轉(zhuǎn)移是一種可行的方法。

現(xiàn)在已經(jīng)在研究并認(rèn)為有效的有以下幾種方法：①、通過(guò)分析TILs從而篩選獲得特異識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞受體用以改造外周血T細(xì)胞，從而獲得腫瘤殺傷性TCR-T細(xì)胞并進(jìn)行抗腫瘤治療；②、采用二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)TILs進(jìn)行分析和篩選，從而獲得促進(jìn)T細(xì)胞殺傷腫瘤的基因及T細(xì)胞表征，用以改造CAR-T(嵌合抗原受體T細(xì)胞)和TCR-T細(xì)胞，提高這些細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷力。

目前的TILs用于腫瘤治療過(guò)程大致分為以下幾個(gè)：①收集手術(shù)切下的腫瘤組織(原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤)或腫瘤引流淋巴組織或癌性胸腹水；②機(jī)械處理或酶消化，然后密度梯度離心，分離TILs；③體外擴(kuò)增培養(yǎng)TILs，傳統(tǒng)方式為加用IL-2及抗CD3抗體，現(xiàn)在也有加用IL-7或IL-15，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，維持TILs中CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞比例，使得體外擴(kuò)增的T細(xì)胞具有更好的表型；④將擴(kuò)增的T細(xì)胞回輸病人體內(nèi)。

然而，TILs療法相較于其他細(xì)胞免疫方法來(lái)說(shuō)，盡管在腫瘤殺傷方面具有優(yōu)勢(shì)，但是，也存在一定的局限性，主要表現(xiàn)為：①TILs制備技術(shù)復(fù)雜，相較于利用外周血制備CAR-T或TCR-T細(xì)胞而言，分離、培養(yǎng)、體外擴(kuò)增TILs的過(guò)程更為復(fù)雜；②TILs中更多的是T細(xì)胞分化中末端的效應(yīng)T細(xì)胞，雖然具備較強(qiáng)的殺傷功能，但缺乏記憶和長(zhǎng)期增殖能力；③TILs的來(lái)源局限于新鮮且無(wú)菌保存的腫瘤組織或轉(zhuǎn)移性腫瘤形成的體液，對(duì)于無(wú)法提供此類組織或體液的病人則無(wú)法獲得這種療法；④部分患者的腫瘤組織內(nèi)TILs過(guò)少或沒(méi)有，無(wú)法分離獲得TILs，而且往往這類病人預(yù)后更差，迫切需要免疫治療。