本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定的堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物的制備方法，以聚谷氨酸(PGA)、1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、以及半胱胺S?磷酸鹽為原料合成PGA(SPO₃)₂₄。再用該交聯(lián)劑處理堿性磷酸酶，最后聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶通過STMCC與抗體偶聯(lián)得到聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物。本發(fā)明通過交聯(lián)反應(yīng)提升堿性磷酸酶的穩(wěn)定性，與使用非交聯(lián)的堿性磷酸酶相比，本發(fā)明制備的聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物尺寸更小且熱穩(wěn)定性更強。聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物保留其天然催化活性的75?90％，聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物的酶活性比未交聯(lián)的對照組偶聯(lián)物高1倍左右。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物的制備方法。

背景技術(shù)

堿性磷酸酶(ALP；EC 3.1.3.1)是酶聯(lián)免疫吸附測定和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析體系中常用的抗體標(biāo)記酶。這是由于ALP催化的酶促反應(yīng)具有較高穩(wěn)定性和比活力，而且有很多性能優(yōu)異的熒光底物及化學(xué)發(fā)光底物與之相匹配。盡管ALP具有良好的熱穩(wěn)定性，但根據(jù)以往的研究經(jīng)驗，ALP-IgG偶聯(lián)綴合物的長期保存會導(dǎo)致酶信號的逐漸丟失。因為ALP通常以二聚體形式存在，而單亞基的ALP活性幾乎為零，ALP的長時間存放會導(dǎo)致二聚體發(fā)生解聚而使酶活力喪失。

化學(xué)交聯(lián)法是一種有效的穩(wěn)定蛋白質(zhì)方法，可有效防止多聚體酶四級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。常規(guī)的交聯(lián)方法通常會導(dǎo)致分子間發(fā)生交聯(lián)，如用戊二醛交聯(lián)多聚體酶。分子間交聯(lián)會導(dǎo)致聚合物的分子量過大，蛋白活力降低，溶解度降低。嚴(yán)重影響酶在生物傳感器或其他生物測定方面的應(yīng)用。所以需要一種制備方法，使制備的得到的酶標(biāo)抗體的穩(wěn)定性好，能夠提高酶的活性。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物的制備方法。本發(fā)明首先制備得到一種聚合物交聯(lián)劑PGA(SPO₃)₂₄，再用該交聯(lián)劑處理堿性磷酸酶得到聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶，最后聚合物交聯(lián)堿性磷酸酶通過STMCC與抗體偶聯(lián)，該方法可顯著提高酶標(biāo)抗體的穩(wěn)定性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種聚合交聯(lián)劑PGA(SPO₃)₂₄的合成方法，包括以下步驟：

將PGA和半胱胺S-磷酸鹽溶解于去離子水中，加入EDC反應(yīng)，將得到的產(chǎn)物純化，然后冷凍干燥，制得聚合交聯(lián)劑PGA(SPO₃)₂₄。

優(yōu)選的，所述PGA、EDC和半胱胺S-磷酸鹽的質(zhì)量比為1:1:(0.1～0.4)。

優(yōu)選的，所述EDC每半小時添加一次，直至添加完畢，繼續(xù)反應(yīng)半小時，結(jié)束反應(yīng)。

本發(fā)明的第二方面，提供上述合成方法制備得到的聚合交聯(lián)劑PGA(SPO₃)₂₄。

本發(fā)明的第三方面，提供上述PGA(SPO₃)₂₄在如下1)或2)中的應(yīng)用：

1)交聯(lián)堿性磷酸酶；

2)提高堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的第四方面，提供利用PGA(SPO₃)₂₄對堿性磷酸酶進行交聯(lián)的方法，包括以下步驟：

(1)用琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-1羥酸酯修飾堿性磷酸酶表面的氨基，使分子表面的氨基衍生出馬來酰胺基團，得到SMCC修飾的堿性磷酸酶；