本發明屬于基因工程領域，具體涉及谷子葉片直接PCR擴增的方法。本發明的谷子葉片直接PCR擴增的方法，包括以下步驟：將谷子葉片放入MgCl₂溶液終濃度為4mM的PCR反應體系中，進行PCR擴增。本發明的PCR擴增方法不需要提取DNA，直接利用葉片進行DNA的PCR擴增，可以大大提高分子檢測實驗的效率。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及谷子葉片直接PCR擴增的方法。

背景技術

谷子(學名：Setaria italica)：屬禾本科的一種植物。古稱稷、粟，亦稱粱。一年生草本；稈粗壯、分蘗少，狹長披針形葉片，有明顯的中脈和小脈，具有細毛。

在谷子分子育種的實驗工作中，經常需要對大量材料進行PCR擴增檢測。現有技術的常規做法是用CTAB植物基因組DNA提取法，雖然可以獲得質量高的DNA，滿足大多數的分子檢測需求。但傳統的CTAB植物基因組DNA提取法提取步驟多，再進行PCR擴增，并需要用到苯酚、氯仿等多種有毒的有機溶劑，因此，成本較高、提取時間較長，并對操作人員、環境產生不利影響。

如果直接用葉子進行PCR擴增，由于葉子中的各種雜質抑制了PCR酶活性，導致了PCR擴增效率低下，甚至無PCR產物，若選用抗耐性高的PCR酶，成本隨之大幅增加。同時，其它的PCR增強劑，如BSA、DMSO、甲酰胺等，常常在模板GC含量70％，或者引物有二級結構的時候應用，使用上述增強劑可以打開這些結構，增加特異性，降低退火溫度，但是會使PCR產率降低，且需要增加taq酶的量以保證擴增的完成。

發明內容

本發明的目的在于提供一種谷子葉片直接PCR擴增的方法。

根據本發明具體實施方式的谷子葉片直接PCR擴增的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將谷子葉片放入MgCl₂溶液終濃度為4mM的PCR反應體系中，谷子葉片的體積為1uL；

(2)進行PCR擴增。

根據本發明具體實施方式的谷子葉片直接PCR擴增的方法，所述PCR擴增包括以下步驟：

(a)預變性：94℃5min，1個循環；

(b)擴增：94℃30s，55℃30s，72℃20s，35個循環；

(c)再延伸：72℃10min，1個循環；

(d)保存：4℃10min，1個循環。

根據本發明具體實施方式的谷子葉片直接PCR擴增的方法，所述PCR反應體系包括PCR MASTER MIX 20～30uL、引物1～2uL、ddH₂O 15～25uL、20mM MgCl₂溶液2～3uL，PCR反應體系的體積為50uL。

根據本發明具體實施方式的谷子葉片直接PCR擴增的方法，所述PCR MASTER MIX包括Taq DNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl₂以及緩沖液。

其中，做PCR時MASTER MIX是指反應混合物，即PCR試驗時使用的預混物。所述PCRMASTER MIX包括Taq DNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl₂溶液以及緩沖液。現有技術存在多種市售Master Mix，一般的PCR Master Mix都是兩倍的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以，優選的，本發明的2×Hieff^TMPCR Master Mix(No Dye)為上海翊圣生物科技有限公司生產。

根據本發明具體實施方式的谷子葉片直接PCR擴增的方法，向所述PCR反應體系中添加2.5uL 20mM MgCl₂溶液。