本發明涉及一種gE?HEK293細胞的構建方法及其應用，所述方法包括如下步驟：構建重組質粒，重組質粒轉染，重組細胞株構建：將gE?HEK293細胞和HEK293細胞加壓篩選，獲得初代gE?HEK293細胞，在培養箱中培養后選取gE蛋白表達量最高的單克隆細胞進行傳代培養，直至傳代后的gE?HEK293細胞能夠穩定表達gE蛋白，形成最終能夠表達gE蛋白的gE?HEK293細胞。本發明構建的gE?HEK293細胞能夠穩定表達gE蛋白，并且可以用于FAMA實驗、流式細胞術和細胞ELISA檢測VZV?gE的特異性抗體，檢測過程中使用構建的gE?HEK293細胞能夠簡化操作過程，快速獲得檢測結果。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種gE-HEK293細胞的構建方法及其應用。

背景技術

水痘是由水痘帶狀皰疹病毒引起的一種疾病，主要見于兒童，在人群中具有極高的感染率。IgG是機體感染水痘后產生的兩種主要中和抗體之一，檢測血清中水痘IgG抗體在水痘血清流行病學研究、水痘疫苗的免疫效果評價、臨床診斷等方面具有重要意義。Williams等首先在1974年報道了用FAMA(膜熒光抗體)法檢測水痘病毒IgG抗體。因為該方法能區分水痘的易感者和免疫者，只要未檢測出抗體就表明該個體是VZV(水痘-帶狀皰疹病毒)易感者，只要檢測出抗體，就表明該個體具有免疫力，此外，FAMA法檢測到血清抗體滴度轉換，就表明周圍有水痘發生。FAMA法敏感性高、特異性好、未發現與其他皰疹病毒產生交叉反應，被稱為是水痘IgG抗體檢測的“金標準”。

常規的FAMA實驗，以VZV感染MRC-5細胞為抗原，熒光標記的抗血清抗體為二抗，檢測血清中抗VZV的特異性IgG抗體，其形成的抗原抗體復合物主要位于感染細胞表面，熒光顯微鏡下觀察可見膜性環狀熒光。此方法的結果判斷受主觀因素影響較大，操作過程繁瑣，需要提前使用病毒感染細胞，試驗耗時長，不宜進行大批量檢測。需要使用到病毒操作，涉及到生物安全，至少需要生物安全二級實驗室才能開展。通常用于FAMA法的抗原細胞，用合適滴度的VZV病毒感染MRC-5細胞，待細胞病變達到++--+++，將病變細胞從細胞培養瓶中消化下來，吸附到載玻片上，經固定后再用于檢測。抗原細胞制備復雜，對細胞病變判斷需要一定經驗，不利于實驗重復性。

流式細胞術是一種在單個細胞水平上分析細胞特性的定量技術，現有技術中可利用流式細胞術分析腺病毒感染滴度。但采用MRC-5細胞感染水痘病毒后，細胞聚集嚴重，無法進行水痘病毒的滴度檢測。

因此需要一種能夠方便檢測IgG抗體并能夠定量檢測水痘病毒的細胞。

發明內容

針對上述問題，本發明涉及一種gE-HEK293細胞的構建方法及其應用。

一種gE-HEK293細胞的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：

構建重組質粒：將水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白gE基因序列片段按HEK293細胞表達系統進行密碼子優化形成目的基因，并將目的基因連接至表達載體上，形成重組質粒；

重組質粒轉染：將重組質粒用限制性內切酶在30±2℃下反應3-5h，利用乙醇沉淀回收法獲得線性化質粒，采用脂質體轉染法將線性化質粒轉染至HEK293細胞，將能夠表達gE蛋白的HEK293細胞作為初代gE-HEK293細胞；

重組細胞株構建：將初代gE-HEK293細胞和HEK293細胞用Hygromycin?B加壓篩選；

待HEK293細胞全部死亡后，將初代gE-HEK293細胞計數并按照1個細胞/孔的密度鋪板，在培養箱中培養后選取gE蛋白表達量最高的單克隆細胞進行傳代培養，傳代后的gE-HEK293細胞能夠穩定表達gE蛋白，形成最終能夠表達gE蛋白的HEK293細胞。

進一步地，所述gE基因序列片段通過在水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白gE基因序列的上下游添加Hind?III和Xho?I酶切位點，再通過序列合成的方式獲得gE基因序列片段。