[發明專利]一種gE-HEK293細胞的構建方法及其應用有效
| 申請號： | 202110194448.1 | 申請日： | 2021-02-20 |
| 公開（公告）號： | CN112941031B | 公開（公告）日： | 2023-06-27 |
| 發明（設計）人： | 譚小東;周云;莊宗蘭;方超;祁碧玉;楊世龍 | 申請（專利權）人： | 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司;重慶智飛生物制品股份有限公司;北京智飛綠竹生物制藥有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/38;C12N15/85;G01N33/569;G01N33/543 |
| 代理公司： | 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594 | 代理人： | 史光偉;張迎新 |
| 地址： | 230088 安*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 ge hek293 細胞 構建 方法 及其 應用 | ||
1.一種gE-HEK293細胞的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟：
構建重組質粒：將水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白gE基因序列片段按HEK293細胞表達系統進行密碼子優化形成目的基因，并將目的基因連接至表達載體上，形成重組質粒；密碼子優化后的目的基因序列如序列表所示；
重組質粒轉染：將重組質粒用限制性內切酶在30±2℃下反應3-5h，利用乙醇沉淀回收法獲得線性化質粒，采用脂質體轉染法將線性化質粒轉染至HEK293細胞，將能夠表達gE蛋白的HEK293細胞作為初代gE-HEK293細胞；
重組細胞株構建：將初代gE-HEK293細胞和HEK293細胞用Hygromycin?B加壓篩選；
待HEK293細胞全部死亡后，將初代gE-HEK293細胞計數并按照1個細胞/孔的密度鋪板，在培養箱中培養后選取gE蛋白表達量最高的單克隆細胞進行傳代培養，所述選取gE蛋白表達量最高的單克隆細胞進行傳代培養包括：在初代gE-HEK293細胞培養結束后，選擇有單克隆生成的細胞孔，加藥篩選培養，通過ELISA檢測篩選表達量最高的單克隆細胞進行擴大培養，重復加壓篩選以及挑選表達量最高的單克隆細胞的步驟，直至HEK293細胞能夠穩定表達gE蛋白完成傳代培養。
2.根據權利要求1所述的gE-HEK293細胞的構建方法，其特征在于，所述gE基因序列片段通過在水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白gE基因序列的上下游添加Hind?III和Xho?I酶切位點，再通過序列合成的方式獲得gE基因序列片段。
3.根據權利要求1所述的gE-HEK293細胞的構建方法，其特征在于，所述培養箱的培養條件為：轉染細胞在37℃、5％CO2下培養12-14天。
4.利用權利要求1-3任意一項所述的gE-HEK293細胞進行非診斷目的的FAMA檢測的方法，其特征在于，所述方法包括：
胰酶消化gE-HEK293細胞，將細胞稀釋固定在載玻片上；
將稀釋后的VZV抗體血清加入到含有gE-HEK293細胞的載玻片中，4℃靜置16-18h；
用PBS洗滌含血清的載玻片，并加入稀釋的FITC標記的羊抗鼠二抗，37℃避光孵育1h；
PBS洗滌孵育后的載玻片，置于熒光顯微鏡下觀察，所述gE-HEK293細胞表面能夠形成邊界清晰膜性熒光環。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述細胞稀釋固定在載玻片上包括：將消化后的細胞稀釋至6×105個/ml密度，取10μl細胞加至12孔載玻片，置于37℃晾干；所述細胞稀釋后固定在載玻片上所用的固定液為80％冷丙酮，固定時間為5min。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述FITC標記的羊抗鼠二抗為含1％伊文思藍的FITC標記的羊抗鼠二抗，稀釋比例為1:100。
7.利用權利要求1-3任意一項所述的gE-HEK293細胞進行非診斷目的的流式細胞術檢測的方法，其特征在于，所述方法包括：
稀釋gE-HEK293細胞至所需濃度，取100μl稀釋后的gE-HEK293細胞；
將稀釋后的VZV抗體血清加入100μl的gE-HEK293細胞中，37℃孵育1h；
加入標記抗體，37℃孵育1h；
重懸加入標記抗體后的gE-HEK293細胞，進行流式細胞儀上樣，收集檢測數據。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述標記抗體為1:100稀釋的FITC標記的羊抗鼠二抗，所用標記抗體體積為100μl。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述重懸加入標記抗體后的gE-HEK293細胞包括：首先用PBS重懸加入標記抗體后的gE-HEK293細胞，1000rpm離心5min，重復2次，用500μl?PBS重懸離心后的gE-HEK293細胞，流式細胞儀上樣。
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