本發(fā)明提供了一種永生化林麝香腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法。它包括下述步驟：(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺組織；(2)將林麝香腺組織的林麝香腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離純化，得到純化后的林麝香腺上皮細(xì)胞；(3)將純化后的林麝香腺上皮細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)染的林麝香腺上皮細(xì)胞；(4)將轉(zhuǎn)染的林麝香腺上皮細(xì)胞通過嘌呤霉素篩選出轉(zhuǎn)染成功的林麝香腺上皮細(xì)胞；(5)對(duì)篩選出的轉(zhuǎn)染成功的林麝香腺上皮細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，即可獲得永生化林麝香腺上皮細(xì)胞。本發(fā)明提供的永生化林麝香腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式永生化香腺上皮細(xì)胞，培養(yǎng)12代以后完全能保持上皮細(xì)胞的特性，克服了上皮細(xì)胞凋亡的缺點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種永生化林麝香腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

麝香是傳統(tǒng)中藥的重要成分。《中國藥典》2020年版記載，麝香具有開竅醒神，活血通經(jīng)，消腫止痛的功效。現(xiàn)代藥學(xué)著作均視麝香為藥材之珍品。在中成藥及成藥的實(shí)際應(yīng)用中，麝香常居牛黃、犀角、熊膽等名貴動(dòng)物藥材之首?！度珖谐伤幪幏郊肥蛰d的2621個(gè)處方中，含麝香的處方就有295個(gè)。由于天然麝香的產(chǎn)量極低，每頭雄性林麝每年只能產(chǎn)15克左右，因此麝香就顯得極其珍貴，市場(chǎng)價(jià)格在黃金的3倍以上，香腺上皮細(xì)胞是香腺中起分泌作用的功能細(xì)胞，每年5月下旬前后，林麝香腺開始腫大，香腺細(xì)胞分泌的初香液順著導(dǎo)管流入香囊中。這些研究結(jié)果使人們對(duì)林麝香腺的宏觀解剖結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)有了較為全面的了解。

為了滿足市場(chǎng)對(duì)麝香的需求，近年來，科研人員正積極尋求通過細(xì)胞生物學(xué)體外培養(yǎng)的方法獲取麝香。前人也為此進(jìn)行了嘗試，但無法克服林麝香腺組織采集困難、香腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)緩慢、林麝香腺上皮細(xì)胞凋亡的問題。

本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下技術(shù)問題：

1、由于目前無有效安全的林麝麻醉方法，因此現(xiàn)有麻醉林麝采集香腺組織的方法對(duì)林麝造成傷害，且細(xì)胞量不足；

2、現(xiàn)有技術(shù)中在對(duì)林麝香腺細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；

3、現(xiàn)有技術(shù)中在林麝香腺細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在上皮細(xì)胞培養(yǎng)到第5代以后就凋亡了，無法滿足體外細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)麝香的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種永生化林麝香腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中林麝香腺細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在上皮細(xì)胞培養(yǎng)到第5代以后就凋亡的技術(shù)問題。本發(fā)明提供的諸多技術(shù)方案中的優(yōu)選技術(shù)方案所能產(chǎn)生的諸多技術(shù)效果詳見下文闡述。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的一種永生化林麝香腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括下述步驟：

(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺組織；

(2)將步驟(1)采集的林麝香腺組織的林麝香腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離純化，得到純化后的林麝香腺上皮細(xì)胞；

(3)將步驟(2)得到的純化后的林麝香腺上皮細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)染的林麝香腺上皮細(xì)胞；

(4)將步驟(3)中得到的轉(zhuǎn)染的林麝香腺上皮細(xì)胞通過嘌呤霉素篩選出轉(zhuǎn)染成功的林麝香腺上皮細(xì)胞；

(5)對(duì)篩選出的轉(zhuǎn)染成功的林麝香腺上皮細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，即可獲得永生化林麝香腺上皮細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中，所述林麝香腺組織采集后立即轉(zhuǎn)移至含有青鏈霉素的PBS中。

進(jìn)一步的，所述青鏈霉素為100U/ml。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，林麝香腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離純化的方法包括下述步驟：