[發明專利]一種永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法在審
| 申請號： | 202110034355.2 | 申請日： | 2021-01-12 |
| 公開（公告）號： | CN113025661A | 公開（公告）日： | 2021-06-25 |
| 發明（設計）人： | 竭航;鄭程莉;趙春容;張明;任妍 | 申請（專利權）人： | 重慶市藥物種植研究所;四川養麝研究所 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N15/65;C12N5/10;C12N5/071 |
| 代理公司： | 昆明盈正知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53208 | 代理人： | 徐洪剛 |
| 地址： | 408435 重*** | 國省代碼： | 重慶;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 永生 麝香 上皮細胞 構建 方法 | ||
1.一種永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：包括下述步驟：
(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺組織；
(2)將步驟(1)采集的林麝香腺組織的林麝香腺上皮細胞與成纖維細胞進行分離純化，得到純化后的林麝香腺上皮細胞；
(3)將步驟(2)得到的純化后的林麝香腺上皮細胞慢病毒轉染，獲得轉染的林麝香腺上皮細胞；
(4)將步驟(3)中得到的轉染的林麝香腺上皮細胞通過嘌呤霉素篩選出轉染成功的林麝香腺上皮細胞；
(5)對篩選出的轉染成功的林麝香腺上皮細胞進行擴增培養，即可獲得永生化林麝香腺上皮細胞。
2.根據權利要求1所述的永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：所述步驟(1)中，所述林麝香腺組織采集后立即轉移至含有青鏈霉素的PBS中。
3.根據權利要求2所述的永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：所述青鏈霉素為100U/ml。
4.根據權利要求1所述的永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)中，林麝香腺上皮細胞與成纖維細胞進行分離純化的方法包括下述步驟：
①將步驟(1)采集的林麝香腺組織剪碎至1-2mm3；然后在0.05-0.3％的IV型膠原酶36-38℃消化3-5小時；然后用完全培養基重懸浮洗滌2-4次；1300-2000r/m離心2-3min，收集上清液；
②將步驟①收集的上清液接種于完全培養基中，所述完全培養基中血清的含量為10％；在37℃、5％二氧化碳、飽和濕度下進行培養，每24h-36h換液1次；
③培養3-5天后，待成纖維細胞貼壁，而上皮細胞未貼壁時，吸取上清液，接種于另一個細胞瓶中；
④繼續培養2-3天后，上皮細胞開始貼壁生長，更換完全培養基，更換的完全培養基中血清含量為2-5％；如還有成纖維細胞貼壁，則采用無菌接種環刮除成纖維細胞團塊；
⑤繼續培養7-10天后，單層上皮細胞加速生長時，更換完全培養基，更換的完全培養基中血清含量為8-10％，繼續進行培養；培養后得到純化后的林麝香腺上皮細胞。
5.根據權利要求4所述的永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：所述步驟①和步驟②中所使用的完全培養基是以DMEM為基礎培養基，并添加有雙抗、血清和EPC因子，所述雙抗的含量為1％，所述血清的含量為10％，所述EPC因子的含量為10-15ng/ml；
所述步驟③中所使用的完全培養基是以DMEM為基礎培養基，并添加有雙抗、血清和EPC因子，所述雙抗的含量為1％，所述血清的含量為2-5％，所述EPC因子的含量為10-15ng/ml；
所述步驟⑤中所使用的完全培養基是以DMEM為基礎培養基，并添加有雙抗、血清和EPC因子，所述雙抗的含量為1％，所述血清的含量為8-10％，所述EPC因子的含量為10-15ng/ml；當單層細胞開始匯合時，采用0.25-0.50mg/ml胰蛋白酶消化。
6.根據權利要求1所述的永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：所述步驟(3)中，所述慢病毒轉染為SV40病毒轉染，具體為：為步驟(2)得到的純化后的林麝香腺上皮細胞接種6孔板，每孔細胞數約為1×105個；第二天，待細胞貼壁后，換液，加入1mL完全培養基，再加20μL SV40過表達慢病毒，混勻后繼續培養，12h后觀察細胞狀態，并更換為新鮮的完全培養基，當細胞長滿板底后，傳代至T25培養瓶中，培養后獲得永生化林麝香腺上皮細胞。
7.根據權利要求6所述的永生化林麝香腺上皮細胞的構建方法，其特征在于：所述步驟(3)中，所使用的完全培養基是以DMEM為基礎培養基，并添加有雙抗、血清和EPC因子，所述雙抗的含量為1％，所述血清的含量為10％，所述EPC因子的含量為10-15ng/ml。
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