本發明屬于酶工程技術領域，具體涉及一種腺嘌呤含量及RIP活性測定方法。針對現有RIP活性測定方法中存在的缺陷，本發明提供一種用于腺嘌呤測試的顯色液，由黃嘌呤氧化酶和BCIP組成。本發明還提供腺嘌呤測試的方法，其將待測樣品與黃嘌呤氧化酶和BCIP反應后，測試光吸收值。本發明還提供RIP活性測試方法：將RIP溶液與ATP或NAD⁺混合反應后測試溶液中的腺嘌呤濃度計算RIP活性。本發明可以用于檢測生物樣本中RIP的動態合成情況、發現新的RIP的存在、檢測和跟蹤分離純化過程中RIP的去向等。

技術領域

本發明屬于酶工程技術領域，具體涉及一種腺嘌呤含量及RIP活性測定方法。

背景技術

核糖體失活蛋白(Ribosome-inactivating protein,RIP)是一類具有N-糖苷酶活性，能使真核細胞核糖體失活而抑制蛋白質合成的毒蛋白，廣泛存在于被子植物、細菌、真菌和藻類中。RIP具有廣譜抗腫瘤、抗病毒、免疫調節等多種生物功能，對正常細胞毒性卻很小，近幾十年來一直受到全球科學家的廣泛關注和研究。

對RIP的研究和開發方面，長期以來存在的一個嚴重問題——尚沒有一種簡潔且可靠的方法來測定RIP的活性。目前，已有的方法大致有以下幾種：①測定體外RIP抑制無細胞系統蛋白質生物合成。此方法不但操作復雜，而且涉及到放射性同位素，對實驗室條件要求較高；②rRNA與RIP反應，用酸性苯胺處理其產物，再用變性RNA電泳檢測。這種方法要求器皿和試劑要經DEPC處理，以保證無RNase干擾，而且只能做定性分析；③RIP與RNA反應，反應產物用RP-HPLC法檢測游離的腺嘌呤量。這種方法能定量分析，但一次只能分析一個樣品，若有大量樣品就顯得十分不便；④通過測定RIP體外抑制腫瘤細胞增殖來標定其活性，這種方法需要繁雜的細胞培養過程，測定時間長；⑤RIP與rRNA類似底物反應，生成的腺嘌呤被耦聯酶轉化為可比色的產物。但這種方法則需要2種或2種以上的耦聯酶，成本較高。

由于現有RIP活性測定技術中存在實驗室條件要求高、需保證無RNase干擾、對大量樣品測試不便、測定時間長或成本高等問題，亟待尋找一種可定量、簡便、快速、成本低并可以推廣的RIP活性測定方法。

發明內容

針對現有RIP活性測定方法中存在的缺陷，本發明提供一種用于腺嘌呤測試的顯色液及測試方法，以及包括該方法的RIP活性測試方法，目的在于：通過簡便、快速、低成本的方法定量測試RIP活性。

一種用于腺嘌呤測試的顯色液，它是由酶和BCIP溶解于pH 6.5-7.5緩沖液制成，所述酶為黃嘌呤氧化酶。所述BCIP為2，6-二氯酚吲哚酚。

優選的，所述顯色液中，含酶量和BCIP的用量比例為3.0-4.5U:70-76μmol，優選為，4U：72μmol。

優選的，包括如下步驟：

(1)取含有腺嘌呤的待測樣品，加入上述顯色液，反應；

(2)測定600-612nm處的光吸收值，優選為606nm處的光吸收值。

優選的，步驟(1)中：

在每毫升反應體系中，所述酶的加入量為1-1.5U，所述BCIP加入量為23.33-24.13μmol；優選的，所述酶的加入量為1.33U，所述BCIP加入量為24μmol；

和/或，所述反應溫度為35-39℃，優選為37℃，反應時間為20-40min，優選為30min，反應pH條件為6.5-7.5；優選的，所述pH7.0。

優選的，所述待測樣品中含有腺嘌呤的濃度范圍為≤220μM；