[發明專利]一種腺嘌呤含量及RIP活性測定方法在審
| 申請號： | 202011532874.3 | 申請日： | 2020-12-22 |
| 公開（公告）號： | CN112730284A | 公開（公告）日： | 2021-04-30 |
| 發明（設計）人： | 孟堯;孟延發 | 申請（專利權）人： | 成都醫學院 |
| 主分類號： | G01N21/31 | 分類號： | G01N21/31;G01N1/38 |
| 代理公司： | 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222 | 代理人： | 張娟;鄭勇力 |
| 地址： | 610000 四川省*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 嘌呤 含量 rip 活性 測定 方法 | ||
1.一種用于腺嘌呤測試的顯色液，其特征在于：它是由酶和BCIP溶解于pH 6.5-7.5緩沖液制成，所述酶為黃嘌呤氧化酶。
2.按照權利要求1所述的顯色液，其特征在于：所述顯色液中，含酶量和BCIP的用量比例為3.0-4.5U:70-76μmol，優選為，4U：72μmol。
3.一種腺嘌呤含量的間接測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)取含有腺嘌呤的待測樣品，加入權利要求1或2所述的顯色液，反應；
(2)測定600-612nm處的光吸收值，優選為606nm處的光吸收值。
4.按照權利要求3所述的測定方法，其特征在于：步驟(1)中：
在每毫升反應體系中，所述酶的加入量為1-1.5U，所述BCIP加入量為23.33-24.13μmol；優選的，所述酶的加入量為1.33U，所述BCIP加入量為24μmol；
和/或，所述反應溫度為35-39℃，優選為37℃，反應時間為20-40min，優選為30min，反應pH條件為6.5-7.5；優選的，所述pH7.0。
5.按照權利要求3所述的測定方法，其特征在于：所述待測樣品中含有腺嘌呤的濃度≤220μM；
和/或，所述待測樣品中腺嘌呤濃度的計算公式為：ΔA＝k×(A-A0)，其中，ΔA為腺嘌呤濃度，k為吸光度隨腺嘌呤濃度的變化率，A為檢測得到的吸光度，A0為溶液中腺嘌呤濃度為0時檢測得到的吸光度。
6.一種RIP活性的測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
(a)將RIP溶液與反應底物混合，反應，得到含有腺嘌呤的反應液；
(b)將步驟(a)的反應液作為待測樣品，按照權利要求3～5任一項所述的測定方法進行測試，得到光吸收值。
7.按照權利要求6所述的測定方法，其特征在于：步驟(a)中：
所述的反應底物選自ATP或NAD+；
和/或，所述反應體系中，反應底物的濃度為8-15mM，優選為10mM；
和/或，所述反應溫度為50-55℃，優選為53℃，反應時間為30-50min，優選為30min，反應pH條件為2.0-3.5；優選的，所述pH由磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液控制。
8.按照權利要求6所述的測定方法，其特征在于：所述RIP活性通過如下公式計算：
U＝(ΔA/t)×(Vt/Ve)或U/mg＝(ΔA/t)×(Vt/Ve)/C，
其中，U為活性單位；U/mg為比活性單位，ΔA為腺嘌呤濃度(μM)，Vt為總反應體積(mL)，Ve為RIP體積(mL)；t為反應時間(min)，C為RIP含量(mg)。
9.一種測定植物樣品中的RIP活性的方法，其特征在于：它是按照權利要求6～8任一項所述的方法測定待測植物樣品的RIP活性。
10.按照權利要求9所述的測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
(Ⅰ)向植物樣品加入液氮并研磨，加入pH 6.5-7.0緩沖溶液后，于4-6℃抽提過夜，分離上清液，既得提取液；
(Ⅱ)將步驟(Ⅰ)得到的提取液作為RIP溶液按照權利要求6～8任一項所述的測定方法測定；
優選的，所述植物樣品與緩沖液的比例為1g﹕2ml；
優選的，所述緩沖溶液為含0.9％NaCI的0.05-0.1M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；
優選的，所述分離上清液的過程為10000-15000g離心15-20min；
優選的，所述植物樣品選自種子、種子胚、發芽種子、莖、根或葉子中的至少一種；和/或，所述植物的種類選自玉米或苦瓜。
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