本發(fā)明提供的雙層微孔芯片，包括第一微孔結(jié)構(gòu)層以及與所述第一微孔結(jié)構(gòu)層連接的第二微孔結(jié)構(gòu)層，所述第一微孔結(jié)構(gòu)層包括若干個(gè)第一層微孔，所述第二微孔結(jié)構(gòu)層包括若干個(gè)第二層微孔，所述第一層微孔的孔徑以及所述第二層微孔的孔徑均保持一致，所述第一層微孔的孔徑及所述第二層微孔的孔徑由小到大，且任意一個(gè)所述第二層微孔具有僅可容納一個(gè)樣本的形狀以及尺寸，本發(fā)明提供的雙層微孔芯片，所述第一層微孔的孔徑及所述第二層微孔的孔徑由小到大設(shè)計(jì)減少了層與層之間的壓力差，防止了微孔芯片的堵塞，保證了高通量且通過第一層微孔的截留篩選，提高了篩選捕獲的信噪比以及篩選能力。另外，本發(fā)明還提供了上述雙層微孔芯片制備方法以及包括上述雙層微孔芯片的生物裝置。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種雙層微孔芯片、雙層微孔芯片制備方法及生物裝置。

背景技術(shù)

細(xì)胞異質(zhì)性研究在人類疾病治療中一直是一項(xiàng)重要的課題，舉例來說，多能性干細(xì)胞雖可應(yīng)用于疾病治療和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，但由于其細(xì)胞功能上的異質(zhì)性，讓多能干細(xì)胞一直難以穩(wěn)定的進(jìn)行細(xì)胞分化。另在癌癥研究中，腫瘤組群內(nèi)一小群被稱為【腫瘤干細(xì)胞】的細(xì)胞被認(rèn)為是造成腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要原因。如果能夠精確的分析出每種細(xì)胞之間的異質(zhì)性，將有助于簡化復(fù)雜的生物現(xiàn)象，并提供疾病治療新的方向。然而單細(xì)胞的分析不同于整個(gè)細(xì)胞群體，在實(shí)驗(yàn)工具上更加具有挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行往往依賴于有限稀釋法(limiting dilution)或者流式細(xì)胞儀(FACS)來完成。

近年來，已經(jīng)有諸多微流控芯片裝置利用不同的原理進(jìn)行單細(xì)胞的篩選以及分析，例如微液滴(microdroplets)、介電泳(dielectrophoresis)、流體動(dòng)力學(xué)(hydrodynamics)以及微孔陣列(microwell array)等方式。對(duì)于需要進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用而言，微液滴細(xì)胞培養(yǎng)法能夠快速地提供單細(xì)胞培養(yǎng)空間，此方法是通過油性介質(zhì)的分離，將單細(xì)胞包裹在細(xì)胞培養(yǎng)液滴內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。然而液滴內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液在液滴形成之后就無法被置換了，此方法不適用于過程中需要更換培養(yǎng)液的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，且液滴中也缺乏能夠讓細(xì)胞附著的基質(zhì)，故無法應(yīng)用于貼附型細(xì)胞的培養(yǎng)。反而微孔設(shè)計(jì)的芯片能夠應(yīng)用于貼壁或者懸浮的細(xì)胞的篩選以及培養(yǎng)。此設(shè)計(jì)只需要在有孔洞狀的結(jié)構(gòu)中，而操作上只需要使用流體力學(xué)或者重力的方式就將細(xì)胞置入微孔內(nèi)。然而為了讓細(xì)胞擁有足夠的生長空間，微孔的設(shè)計(jì)尺寸通常必須遠(yuǎn)大于一個(gè)單細(xì)胞的大小，導(dǎo)致了單細(xì)胞篩選效率普遍下降了10-30％。目前技術(shù)使用的單一微孔所造成的的單細(xì)胞捕獲效率的降低與有限稀釋法都是由于泊松分布的限制。

微孔的設(shè)計(jì)尺寸需要遠(yuǎn)大于一個(gè)單細(xì)胞的大小，導(dǎo)致單細(xì)胞的篩選效率大大降低，另外使用的單一微孔進(jìn)行單細(xì)胞捕獲的技術(shù)其芯片或者系統(tǒng)的流量無法得到精確控制，會(huì)導(dǎo)致單細(xì)胞篩選的過程中出現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的丟失導(dǎo)致篩選效率的降低。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，有必要提供一種單細(xì)胞的篩選效率高的雙層微孔芯片。

為解決上述問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種雙層微孔芯片，包括：第一微孔結(jié)構(gòu)層以及與所述第一微孔結(jié)構(gòu)層連接的第二微孔結(jié)構(gòu)層，所述第一微孔結(jié)構(gòu)層包括若干個(gè)第一層微孔，所述第二微孔結(jié)構(gòu)層包括若干個(gè)第二層微孔，所述第一層微孔的孔徑以及所述第二層微孔的孔徑均保持一致，所述第一層微孔的孔徑及所述第二層微孔的孔徑由小到大，且任意一個(gè)所述第二層微孔具有僅可容納一個(gè)樣本的形狀以及尺寸。

在其中一些實(shí)施例中，所述第一微孔結(jié)構(gòu)層與所述第二微孔結(jié)構(gòu)層一體成型，所述第一微孔結(jié)構(gòu)層的厚度為0.5-20um，所述第二微孔結(jié)構(gòu)層的厚度為20-60um。

在其中一些實(shí)施例中，所述第一層微孔均勻間隔分布在所述第一微孔結(jié)構(gòu)層上，所述第二層微孔均勻間隔分布在所述第二微孔結(jié)構(gòu)層上。

在其中一些實(shí)施例中，所述第一微孔結(jié)構(gòu)層以及所述第二微孔結(jié)構(gòu)層中微孔的孔隙率為3-10％。