本發明公開了一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的探針及方法。當二茂鐵(Fc)標記的雙鏈DNA固定在電極上時，可以獲得強大的電化學信號。但在ALKBH3存在的情況下，由于ALKBH3可以去除Fc?DNA探針的烷基，形成的DNA 3′平末端可以被核酸外切酶III(ExoIII)識別并降解。因此，由Fc產生的電化學信號大大降低，通過電化學信號的改變可以非常容易地檢測到ALKBH3的活性。本發明可以實現較寬的檢測范圍和較低的檢測限，還能夠為臨床檢測前列腺癌提供了一種新方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的探針及方法。

背景技術

ALKBH3，也稱前列腺癌抗原1(PCA-1)，是一種37.9KD的酶，可通過移除核酸堿基中的烷基來修復核酸堿基。它在與DNA損傷相關的多種疾病如腫瘤，神經系統疾病和發育缺陷等中起著核心作用。許多研究表明，ALKBH3在前列腺癌中的表達水平遠高于良性前列腺增生(BPH)，且與前列腺癌的腫瘤分化程度和臨床分期密切相關。因此，ALKBH3的檢測對于加強前列腺癌的早期診斷尤為重要。

目前，ALKBH3的定量檢測方法包括免疫組化和免疫印跡。但上述方法大多繁瑣且耗時，不能在臨床實踐中廣泛使用。更重要的是，這些方法無法檢測ALKBH3的活性，僅能測定其數量。為了避免上述方法的弊端，人們開始采用放射性標記和熒光等方法對細胞裂解物中的ALKBH3的活性進行測定。遺憾的是，它們固有的缺點(例如耗力、靈敏度低和潛在的放射性危害)限制了它們的廣泛使用。

因此，亟需積極探索一種敏感性高，簡單且經濟高效的用于測定ALKBH3活性的方法。

發明內容

針對現有技術中對ALKBH3活性的測定方法靈敏度低和潛在的放射性危害的問題，本發明提供了一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的探針及方法。

一方面，本發明提供了一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的探針，

探針1(DNA 1)序列為5’-TACCCAACCCGCCCACCCTTT-SH-3’(SEQ ID NO.1)；

探針2(DNA 2)序列為5’-(Fc)GGGTGGGCGGGTTGGGTA(m1A)-3’(SEQ ID NO.2)。

另一方面，本發明提供了一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的方法，該方法包括以下步驟：

步驟(1)金電極預處理：

a.將金電極放置于硫酸與H₂O₂的比例為1∶3-3∶7的硫酸-H₂O₂混合液中浸泡10-30分鐘；

b.純水沖洗；

c.放置于濃度為1-3mol/L的硫酸溶液中掃循環伏安，得到預處理后的金電極。

步驟(2)DNA固定：

a.將含有終濃度為1-3μM的DNA 1(SEQ ID NO.1)的固定緩沖液通過Au-S鍵修飾在步驟(1)得到的金電極上并孵育；其中，DNA 1序列的3’端經過巰基(SH)修飾。

b.使用pH 8.0的10mM Tris-HCL的金電極洗滌緩沖液清洗并置于含有2mM 6-巰基己醇(MCH)的Tris-HCL緩沖液孵育20-40分鐘；

c.用洗滌緩沖液和去離子水徹底漂洗；

d.將含有終濃度為1-3μM的DNA 2(SEQ ID NO.2)的DNA雜交緩沖液浸入上述電極的表面并于37℃孵育1-3小時，得到剛性雙鏈DNA；其中，DNA 2序列的5’端經過二茂鐵(Fc)標記，3’端經過1-甲基腺苷(m1A)修飾。

步驟(3)ALKBH3活性分析：