[發(fā)明專利]一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的探針及方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011128300.X | 申請日： | 2020-10-20 |
| 公開（公告）號： | CN112285178B | 公開（公告）日： | 2023-02-17 |
| 發(fā)明（設計）人： | 李金龍;程文婷;胡凱;張永臣;張兆利 | 申請（專利權(quán)）人： | 南京市第二醫(yī)院;南京市高淳人民醫(yī)院;南京鼓樓醫(yī)院 |
| 主分類號： | G01N27/30 | 分類號： | G01N27/30;G01N27/327;C12Q1/6886;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249 | 代理人： | 馮慧 |
| 地址： | 210003 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 烷基 測定 alkbh3 活性 探針 方法 | ||
1.一種基于移除烷基測定ALKBH3活性的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步驟：
(1)金電極預處理：
a.將金電極放置于硫酸-H2O2混合液中浸泡；
b.純水沖洗；
c.放置于硫酸溶液中掃循環(huán)伏安，得到預處理后的金電極；
(2)DNA固定：
a.將含有DNA 1(SEQ ID NO.1)的固定緩沖液通過Au-S鍵修飾在步驟(1)得到的金電極上并孵育，DNA 1的終濃度為1-3μM；
b.使用金電極洗滌緩沖液清洗并置于Tris-HCL緩沖液孵育20-40分鐘；
c.用洗滌緩沖液和去離子水徹底漂洗；
d.將含有DNA 2(SEQ ID NO.2)的DNA雜交緩沖液浸入上述電極的表面并進行孵育，得到剛性雙鏈DNA，DNA 2的終濃度為1-3μM；
(3)ALKBH3活性分析：
a.將金電極浸入ALKBH3中10-30分鐘以去除DNA 2探針3'末端的烷基；
b.使用清洗緩沖液和去離子水連續(xù)清洗電極三次；
c.將電極浸入反應緩沖液于37℃孵育；
d.加熱到60-90℃ 5-15分鐘使ExoIII失活，對ALKBH3活性進行電化學檢測；
其中，DNA 1序列為5’-TACCCAACCCGCCCACCCTTT-SH-3’(SEQ IDNO.1)；
DNA 2序列為5’-(Fc)GGGTGGGCGGGTTGGGTA(m1A)-3’(SEQ IDNO.2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：
步驟(1)-a中，硫酸-H2O2混合液中硫酸與H2O2的比例為1:3-3:7；
步驟(1)-b中，浸泡的時間為10-30分鐘；
步驟(1)-c中，硫酸溶液的濃度為1-3mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：
步驟(2)-b中，金電極洗滌緩沖液為pH 8.0的10mM Tris-HCL；
步驟(2)-b中，Tris-HCL緩沖液含有2mM 6-巰基己醇。
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