本案涉及一種斑馬魚鐵死亡模型的構建方法，包括斑馬魚的繁殖，利用Erastin溶液或枸櫞酸鐵銨溶液處理斑馬魚進行鐵死亡模型的構建，使用臺盼藍對鐵死亡模型進行驗證，出現細胞死亡即成功構建斑馬魚鐵死亡模型。本發明首次使用斑馬魚來定義和研究鐵死亡現象，本發明發現，鐵死亡誘導劑都能明顯地增加斑馬魚體內的ROS產生，誘使細胞死亡數目明顯增加，改變了鐵死亡相關基因的表達。具有便利、快捷、成功率高，易重復等優點，能夠實現鐵死亡在個體水平的定性和定量，使斑馬魚能夠成為便利的模型來研究鐵死亡現象，以及鐵死亡相關的癌癥、血管、骨質疏松、代謝以及其他人類疾病的模型，也能為高通量篩選鐵死亡相關的藥物提供模型。

技術領域

本發明屬于生物技術模型構建領域，具體涉及一種斑馬魚鐵死亡模型的構建方法。

背景技術

細胞死亡是哺乳動物的發育、內環境穩態的維持以及疾病發生的重要環節之一。鐵死亡(Ferroptosis)是細胞死亡的一種方式，在細胞水平，和小鼠的水平已經研究較多。鐵死亡是在谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)調控下鐵依賴性細胞程序性死亡。2014年細胞死亡命名委員會正式命名，鐵死亡有以下4點特征：細胞死亡與鐵水平增加有因果關系，鐵死亡過程需有鐵的參與；脂質過氧化物增加和NADPH減少；線粒體有特殊形態改變；可被親脂抗氧化劑和鐵螯合劑逆轉。鐵死亡與多種病理性細胞死亡相關，例如一些退行性病例改變就是由于修復過氧化脂質的能力下降導致的細胞死亡；鐵死亡可能具有腫瘤抑制功能，它可以去除無法獲取關鍵營養因子或受感染以及因環境改變損傷的細胞。

斑馬魚是一種熱帶鯉科魚，目前被廣泛應用于新藥篩選中。這是因為斑馬魚遺傳背景清晰，與人類基因相似度高達87％，器官病變過程又與人類極為接近。同時，斑馬魚胚胎發育是全透明的，加上適當的色素抑制處理，可以清晰地觀察病變過程，并且斑馬魚體型小、實驗周期短，且維護費用低廉，非常適合于高通量實驗。然而斑馬魚作為生物醫學研究的第三大模式生物，還沒有關于鐵死亡的應用技術和方法。

發明內容

針對現有技術中的不足之處，本發明目的在于提供一種成本低、見效快、模型性能穩定，適用性廣的斑馬魚鐵死亡模型構建方法。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種斑馬魚鐵死亡模型的構建方法，包括以下步驟：

1)斑馬魚的繁殖：將性成熟的斑馬魚按雌雄比＝1:2的比例放入交配魚缸內，插上隔板，雌雄斑馬魚分開；隔夜后開燈換水，取出隔板，待30-60分鐘后收集魚卵；收集到的魚卵置于含E3的培養皿中，挑選受精魚卵，將受精魚卵按100枚/盤的密度進行分盤，加入胚胎培養液，28℃恒溫孵育5小時；

2)鐵死亡模型的構建：挑選步驟1)中孵育正常的斑馬魚，按10-20條/孔的密度分布于6孔板中，加入E3培養液，28℃恒溫孵育24h；除去E3培養液，將6孔板中的受精卵隨機分為DMSO陰性對照組、Erastin處理組和枸櫞酸鐵銨(FAC)處理組，分別向其中加入DMSO、Erastin溶液和FAC溶液，恒溫培養48h；

3)鐵死亡模型的驗證：使用臺盼藍對步驟2)中DMSO陰性對照組、Erastin處理組和FAC處理組的斑馬魚進行活體染色，檢測到細胞死亡現象，即得到斑馬魚鐵死亡模型。

進一步地，所述Erastin溶液的濃度為20μmol/L，FAC溶液的濃度為200μg/ml。

進一步地，所述步驟2)中，恒溫培養的條件為28℃、避光處理。