本發明公開了一種真菌細胞核熒光標記的表達載體、試劑、制備方法及應用。所述載體其表達區包括用于表達組蛋白和熒光蛋白的重組融合蛋白的重組融合蛋白表達序列，所述重組融合蛋白表達序列，包括含有核定位信號的組蛋白表達序列和熒光蛋白表達序列；所述組蛋白表達序列與熒光蛋白表達序列處于同一啟動子的閱讀框中，其中所述組蛋白表達序列缺失終止密碼子且連接于熒光蛋白表達序列上游；所述重組融合蛋白表達序列具有核定位信號，用于表達重組融合蛋白。含有所述表達載體且具有侵染目標真菌細胞能力的重組體，可作為標記真菌細胞的細胞核的標記試劑，能準確地定位到細胞核中，經激發發出熒光，從而安全、永久的標記目標真菌細胞的細胞核。

技術領域

本發明屬于真菌生物技術領域，更具體地，涉及一種真菌細胞核熒光標記的表達載體、試劑、制備方法及應用，尤其是一種形成子實體的大型真菌的細胞核熒光標記表達載體、試劑、制備方法及應用。

背景技術

細胞核標記對于細胞核定位、細胞學研究、以及生物應用技術的開發有著重要意義。例如標記羊肚菌的細胞核，可以觀察細胞核的行為，特別是在菌絲交配核遷移、以及食用菌雜交育種等方面的研究有著重要作用。

然而細胞核的標記方法，大多使用有機熒光染料進行標記，如4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)，有機熒光染料染色雖然靈敏度較高、特異性較強，使用方便，但是有機染料的標記原理是進入活細胞中與DNA結合，通過熒光激發光成像，因此不可避免的對生物體本身具有毒害作用，一方面在使用過程中可能造成環境污染、以及對實驗人員可能造成傷害，另一方面其影響被標記的對象正常的生理活動，從而影響實驗觀測。同時采用熒光染料標記存在著熒光信號易淬滅的問題，多重因素造成現有的細胞核標記方法，不便于對活細胞菌絲體進行系統全面的觀察。

中國專利文件CN109097397A提供了一種將熒光蛋白定位在細胞核中，從而永久標記活細胞的細胞核的標記方法。這種細胞核標記方法不影響細胞的正常生活，可以安全系統的觀察細胞的活動。

然而這一方法，由于載體具有嚴格的選擇性，因此只適合人類細胞的細胞核標記。真菌細胞的細胞核標記，由于真菌細胞結構復雜多樣，進化上與動物、植物親緣關系較遠，因此適用于動植物的轉基因方法簡單的更換載體難以移植到真菌中。尤其是對于形成子實體的大型真菌，由于其生命周期的發育過程復雜，因此這一建立在轉基因技術上的細胞核標記方法，難以成功地在形成子實體的大型真菌上實現。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種真菌細胞核熒光標記的表達載體、試劑、制備方法及應用，其目的在于，通過采用組蛋白與熒光蛋白的融合蛋白表達序列代替現有的核定位信號修飾的熒光蛋白表達序列，更有效的將融合蛋白定位到細胞核中，由此將現有的轉基因永久標記細胞核的技術移植到真菌中，解決無法準確地定位到細胞核的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種真菌細胞核熒光標記的表達載體，其表達區包括用于表達組蛋白和熒光蛋白的重組融合蛋白的重組融合蛋白表達序列，所述重組融合蛋白表達序列，包括含有核定位信號的組蛋白表達序列和熒光蛋白表達序列；所述組蛋白表達序列與熒光蛋白表達序列處于同一啟動子的閱讀框中，其中所述組蛋白表達序列缺失終止密碼子且連接于熒光蛋白表達序列上游；所述重組融合蛋白表達序列具有核定位信號，用于表達重組融合蛋白。

優選地，所述真菌細胞核熒光標記的表達載體，其所述重組融合蛋白表達序列用于表達重組融合蛋白，所述重組融合蛋白包括正確折疊的組蛋白亞基和熒光蛋白亞基。

優選地，所述真菌細胞核熒光標記的表達載體，其所述組蛋白為H₂B蛋白；所述熒光蛋白為綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白，優選為紅色熒光蛋白；優選，所述組蛋白表達序列連接與熒光蛋白表達序列之間具有多克隆位點。

優選地，所述真菌細胞核熒光標記的表達載體，其所述組蛋白的氨基酸序列為：

1)SEQ ID NO.1所示的序列；或