[發(fā)明專利]真菌細胞核熒光標記的表達載體、試劑、制備方法及應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011078505.1 | 申請日： | 2020-10-10 |
| 公開（公告）號： | CN112143752B | 公開（公告）日： | 2021-12-14 |
| 發(fā)明（設計）人： | 康恒;舒芳;邊銀丙;陳新 | 申請（專利權）人： | 華中農(nóng)業(yè)大學 |
| 主分類號： | C12N15/80 | 分類號： | C12N15/80;C12N15/65;C12N15/64;C12N1/21;C12R1/645;C12R1/01 |
| 代理公司： | 武漢臻誠專利代理事務所(普通合伙) 42233 | 代理人： | 胡星馳 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 真菌 細胞核 熒光 標記 表達 載體 試劑 制備 方法 應用 | ||
1.一種真菌細胞核熒光標記的表達載體，其特征在于，其表達區(qū)包括用于表達組蛋白和熒光蛋白的重組融合蛋白的重組融合蛋白表達序列，所述重組融合蛋白表達序列，包括含有核定位信號的組蛋白表達序列和熒光蛋白表達序列；所述組蛋白表達序列與熒光蛋白表達序列處于同一啟動子的閱讀框中，其中所述組蛋白表達序列缺失終止密碼子且連接于熒光蛋白表達序列上游；所述重組融合蛋白表達序列具有核定位信號，用于表達重組融合蛋白；所述重組融合蛋白表達序列用于表達重組融合蛋白，所述重組融合蛋白包括正確折疊的組蛋白亞基和熒光蛋白亞基，組蛋白亞基和熒光蛋白亞基之間無連接肽；所述組蛋白為H2B蛋白；所述熒光蛋白為紅色熒光蛋白；所述組蛋白表達序列為：SEQ ID NO.2所示的序列。
2.如權利要求1所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體，其特征在于，其表達區(qū)還包括用于表達篩選標記的篩選標記基因序列；
還包括用于啟動所述重組融合蛋白表達序列的第一啟動子、以及用于啟動所述篩選標記基因序列的第二啟動子，所述第一、第二啟動子，為待標記的目標真菌細胞的高保守基因強啟動子。
3.如權利要求2所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體，其特征在于，所述表達載體，用于標記羊肚菌細胞核，其表達區(qū)還包括用于表達用作篩選標記基因的潮霉素基因序列。
4.如權利要求2所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體，其特征在于，所述第一啟動子與第二啟動子為不同類型的啟動子，分別調(diào)控融合蛋白的表達和篩選標記基因的表達。
5.如權利要求4所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體，其特征在于，所述第一啟動子為：羊肚菌三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子；第二啟動子為：羊肚菌泛素基因啟動子。
6.一種細胞核標記試劑，其特征在于，包括含有權利要求1至5任意一項所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體且具有侵染目標真菌細胞能力的重組體。
7.如權利要求6所述的細胞核標記試劑，其特征在于，用于標記羊肚菌細胞核，所述重組體為農(nóng)桿菌。
8.如權利要求7所述的細胞核標記試劑，其特征在于，所述重組體為農(nóng)桿菌EHA105。
9.一種如權利要求1至5任意一項的真菌細胞核熒光標記的表達載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
克隆含有核定位信號序列的組蛋白基因序列，將所述含有核定位信號序列的組蛋白基因序列連接到含有熒光蛋白序列的表達載體的表達區(qū)上，使得所述組蛋白基因序列連接于熒光蛋白序列上游；
所述含有核定位信號序列的組蛋白基因序列為H2B基因序列，其核苷酸序列為：SEQ IDNO.2。
10.如權利要求9所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
以目標真菌DNA為模板，設計引物擴增第一和/或第二啟動子，利用同源重組的方法，將擴增得到的兩側(cè)含有載體核苷酸序列的啟動子連接到表達載體表達區(qū)的融合蛋白表達序列和/或篩選標記基因表達序列的上游。
11.如權利要求10所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體的制備方法，其特征在于，采用感受態(tài)細胞擴增所述表達載體，具體操作為將所述表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，繁殖提取質(zhì)粒；所述感受態(tài)細胞為大腸桿菌感受態(tài)細胞。
12.如權利要求11所述的真菌細胞核熒光標記的表達載體的制備方法，其特征在于，所述采用感受態(tài)細胞擴增所述表達載體具體為：
（1）克隆獲得含有核定位信號序列的組蛋白基因序列；
（2）將步驟（1）所述序列連接到羊肚菌含有熒光蛋白序列的表達載體上，其中組蛋白基因序列連接于熒光蛋白序列上游，獲得重組表達載體；
（3）將步驟（2）獲得的重組表達載體擴增：轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒。
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