本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及FRT細(xì)胞株在制備篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的制劑或試劑盒中的應(yīng)用。RT?PCR和Western blot證實(shí)FRT細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)TRPV4；倒置熒光顯微鏡下可觀察到ANO1清晰表達(dá)在FRT細(xì)胞膜上，YFP?H148Q/I152L清晰表達(dá)在FRT細(xì)胞的胞漿中，成功構(gòu)建了共表達(dá)ANO1和YFP?H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型；熒光淬滅動力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該模型可以篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑；該模型可敏感檢測細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化；Z＇因子為0.728，該模型可高通量篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑。綜上，本發(fā)明成功構(gòu)建了一種可以敏感高效篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的高通量模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及FRT細(xì)胞株在制備篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的制劑或試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

瞬時(shí)受體電位離子通道(transient receptor potential，TRP)是一種在生物體內(nèi)分布廣泛的非電壓依賴的、非選擇性陽離子通道，TRP家族分為7個(gè)亞族：TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPN、TRPP及TRPV。瞬時(shí)受體電位香草素受體4型通道蛋白(transientreceptor potential vanilloid receptor 4，TRPV4)是TRPV亞家族的一個(gè)成員，廣泛分布于心臟、大腦、腎臟、肝臟、肺、胰腺、卵巢、骨組織以及皮膚表面。TRPV4調(diào)節(jié)劑在許多生理和病理生理過程中都起著重要作用，如：TRPV4激動劑可以減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，促進(jìn)成年海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞的增值，促進(jìn)血管和動脈的生成；TRPV4拮抗作用可治療水腫，疼痛，胃腸道疾病和肺部疾病，例如咳嗽，支氣管收縮，肺動脈高壓和急性肺損傷。目前TRPV4調(diào)節(jié)劑作用研究還處于初始階段，因其參與許多生理病理過程，有可能是多種疾病的潛在治療靶點(diǎn)。目前，雖然市面上已有TRPV4的激活劑和抑制劑的出現(xiàn)，但是其中大多數(shù)存在選擇性不強(qiáng)、效力不佳等問題。因此，TRPV4的相關(guān)研究成為了當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，篩選TRPV4特異性調(diào)節(jié)劑具有重要研究價(jià)值和科研意義。

目前，篩選離子通道調(diào)節(jié)劑的方法主要有電生理技術(shù)和熒光染料法等。電生理技術(shù)因其直接、靈敏的優(yōu)點(diǎn)而被公認(rèn)為離子通道功能檢測的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法操作繁瑣，成本昂貴，對操作人員技術(shù)要求高，無法適用于高通量藥物篩選。而熒光染料法如Fluo-3、Fluo-4染料等，與Ca²⁺結(jié)合后，染料熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，該方法雖然能夠直觀、實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度變化，但其缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，試劑費(fèi)用高，實(shí)驗(yàn)周期長，限制了TRPV4調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明構(gòu)建了基于鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloridechannels，CaCC)的瞬時(shí)受體勢V4(transient receptor potential vanilloid receptor4，TRPV4)通道調(diào)節(jié)劑的高通量篩選模型。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了FRT細(xì)胞株在制備篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的制劑或試劑盒中的應(yīng)用；所述FRT細(xì)胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表達(dá)；

所述FRT細(xì)胞株通過熒光信號反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度的變化進(jìn)而篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑；

所述熒光信號為相對熒光強(qiáng)度變化值/slope值/斜率值，所述相對熒光強(qiáng)度變化值/slope值/斜率值與TRPV4調(diào)節(jié)劑濃度成劑量依賴關(guān)系；

其中，相對熒光強(qiáng)度變化值/slope值/斜率值與細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)；

所述相對熒光強(qiáng)度變化值/slope值/斜率值計(jì)算如下：

0s～1.4s的相對熒光值的平均值；