本發(fā)明提供了一種基于DNA條形碼鑒定落羽杉屬種質(zhì)資源無性系的方法，屬于植物無性系鑒定領(lǐng)域。該方法包括：提取待鑒定樣品葉綠體DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序，進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以及序列比對(duì)，鑒定出無性系。本發(fā)明利用葉綠體trnI?GAU?rrn16中的一段序列作為DNA條形碼，該序列存在落羽杉屬葉綠體基因組中基因trnI?GAU和rrn16的基因間隔區(qū)，包含較多的變異位點(diǎn)為多種種質(zhì)資源無性系鑒定提供依據(jù)，并采用專用引物進(jìn)行擴(kuò)增，使得本方法能夠?qū)⒙溆鹕紝僦参锊煌瑹o性系進(jìn)行鑒定，實(shí)現(xiàn)了高效，低成本，操作方便的落羽杉屬種質(zhì)資源無性系的鑒定，有利于提升落羽杉屬種質(zhì)創(chuàng)新效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物無性系鑒定領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種基于DNA條形碼鑒定落羽杉屬種質(zhì)資源無性系的方法。

背景技術(shù)

落羽杉屬(Taxodium Rich.)樹種原產(chǎn)美洲和墨西哥，包括三個(gè)類群，落羽杉、墨西哥落羽杉(簡稱墨杉)和池杉，然而將這三個(gè)類群分為一個(gè)種、兩個(gè)種還是三個(gè)種在分類學(xué)上一直爭(zhēng)議不斷。當(dāng)觀察到極端的形態(tài)時(shí)，可以很容易地識(shí)別出這三個(gè)類群的個(gè)體。其中，落羽杉的小葉為線形，也呈螺旋狀排列，但基部扭轉(zhuǎn)成兩列，小枝通常下垂，淡綠色，樹皮較薄。墨杉葉片也是線形，偏平，深綠色，側(cè)生短枝螺旋狀散生，不為2列。而池杉以錐狀到鱗狀的葉子為特征的，螺旋狀排列在通常上升的落葉的嫩枝周圍，樹皮相對(duì)較厚。由于落羽杉、墨杉和池杉的天然地理分布范圍有明顯的重疊，導(dǎo)致存在大量的難以或甚至不可能積極識(shí)別的中間表型存在。落羽杉個(gè)體的上枝上可能有與池杉形態(tài)相似的葉和芽，而濃蔭的池個(gè)體通常表現(xiàn)出與落羽杉相似的葉和芽形態(tài)。一些個(gè)體，甚至整個(gè)種群，可能表現(xiàn)出不同于極端形態(tài)的中間形態(tài)，葉的排列從螺旋狀到假二叉狀不等。正是這些中間體的存在和性質(zhì)引起了關(guān)于落羽杉形態(tài)分類地位的爭(zhēng)論。可見，只靠形態(tài)指標(biāo)很難進(jìn)行落羽杉屬物種的鑒定。

我國開展落羽杉屬樹種的引種栽培工作已經(jīng)有100多年，并從1960s開始進(jìn)行落羽杉屬樹種的雜交、回交工作，優(yōu)良子代無性系“中山杉”具有耐鹽、耐水、抗風(fēng)、抗病、速生、材優(yōu)和樹形優(yōu)美等優(yōu)勢(shì)，已在我國長江流域、東南沿海及內(nèi)陸地區(qū)的湖泊濕地、水網(wǎng)、灘涂和平原綠化造林中廣泛應(yīng)用，目前，已累計(jì)推廣2000多萬株，經(jīng)濟(jì)價(jià)值約20.8億元，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。“江蘇省中國科學(xué)院植物研究所落羽杉屬林木種質(zhì)資源庫”是2018年江蘇省林業(yè)局發(fā)起的，由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所實(shí)施，該資源庫是國內(nèi)唯一的落羽杉無性系資源庫，是落羽杉屬種質(zhì)資源收集、保存、研究和利用的主要平臺(tái)。目前，對(duì)落羽杉屬樹種的鑒定工作主要是借助形態(tài)指標(biāo)，然而，這種分類研究受到季節(jié)變化、栽培管理方式、環(huán)境因素和人為主觀因素的影響。因此，有必要從DNA分子水平上進(jìn)一步開展關(guān)于落羽杉屬種質(zhì)資源無性系鑒定的相關(guān)研究，以提升落羽杉屬種質(zhì)創(chuàng)新效率。

分子標(biāo)記技術(shù)在資源鑒定中的應(yīng)用，可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒別的缺陷。目前，已有的分子標(biāo)記方法有同工酶標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、SRAP標(biāo)記、RAPD標(biāo)記及SSR微衛(wèi)星標(biāo)記等，新的分子標(biāo)記技術(shù)也正處于研究與嘗試中，主要原因是準(zhǔn)確鑒別資源品種越來越重要。DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來代表物種，作為物種的條形碼編碼，從而進(jìn)行物種識(shí)別的分子鑒定新技術(shù)。其概念原理與超市利用條形碼掃描區(qū)分成千上萬種不同的商品相同，流程為收錄已知種名物種的選定標(biāo)準(zhǔn)基因建立條形碼數(shù)據(jù)庫，然后輸入未知種名物種的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，依據(jù)序列相速度來快速鑒定物種。與其他DNA分子鑒定技術(shù)相比，DNA條形碼技術(shù)的重復(fù)性與準(zhǔn)確率更高，并且所需要的引物數(shù)量及投入的人力、物力、時(shí)間顯著減少。合適的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段的選擇是DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用成功的關(guān)鍵。植物DNA條形碼篩選區(qū)域主要集中在葉綠體DNA(choroplast DNA，簡稱cpDNA)和核核糖體DNA(nucleus ribosomal DNA，簡稱nrDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribedspacer，簡稱ITS)。目前，落羽杉屬的DNA條形碼研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容