本發明公開了構建陸地棉抗蟲相關基因編輯突變體庫的方法，涉及植物基因工程技術領域，通過一次性快速構建混合載體文庫，經遺傳轉化獲得陸地棉基因編輯突變體庫材料，利用本發明構建的載體文庫混合侵染陸地棉下胚軸，通過遺傳轉化獲得陸地棉基因編輯突變體庫材料，用高通量的檢測方法對突變體材料進行檢測獲得基因編輯情況，針對棉花抗蟲性狀結合抗蟲鑒定結果篩選有表型的抗感蟲陸地棉基因。該構建陸地棉抗蟲相關基因編輯突變體庫的方法，本發明一次性快速構建了包含968個sgRNA覆蓋502個基因的混合載體文庫用于棉花遺傳轉化，本發明創建了包含五千多份愈傷兩千多份再生植株的棉花基因編輯突變體文庫，突變體庫覆蓋度高達82.07％。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，具體為構建陸地棉抗蟲相關基因編輯突變體庫的方法。

背景技術

基因組學主要研究基因組圖譜制作、基因組測序及注釋、進行基因定位與鑒定基因功能，又分結構基因組學與功能基因組學，結構基因組學以全基因組的測序及注釋為主要內容，功能基因組學以基因功能的鑒定為主要內容。棉花基因組研究相對于水稻、擬南芥、煙草等植物發展落后、緩慢，隨著棉花全基因測序成果的公布，相應的基因序列漸漸知曉，通過全序列分析以及基因的拼接組裝，再結合轉錄組的數據以及生物信息學的分析，可以對基因的功能進行預測，但是預測的基因功能還必須依賴于相應突變體材料進行生物學驗證，突變體是開展遺傳學研究特別是功能基因組學研究中非常重要的材料，建立突變體庫將加快棉花功能基因組學的研究進程。

在自然條件下生物發生突變的概率只有10-5～10-8左右，想獲得自然突變的材料較為困難，對自然突變的材料進行基因定位、基因功能等方面的研究相對繁瑣，隨著技術的不斷發展人工誘導突變體的方法主要有物理、化學途徑誘導，農桿菌介導的插入突變，及基因敲除技術，物理、化學途徑誘導的方向難以掌握，突變體難以集中多個理想性狀，農桿菌介導的插入突變為水稻，玉米等提供了豐富的突變體資源，但插入位點隨機獲得有表型突變體效率不高，對于基因組復雜且組織培養周期長的棉花構建突變體庫不適用。

基因敲除的原理是利用DNA修復DSBs過程中產生的錯誤，誘導NHEJ途徑進行修復，使基因不能正常表達，從而達到阻斷或者破壞某個基因的功能的效果。基因編輯技術包括鋅指核酸酶(ZFN)，類轉錄激活因子核酸酶(TALEN)，規律成簇間隔短回文重復(CRISPR)三類，CRISPR-Cas系統工作原理簡單,成為當今使用最廣的基因編輯工具，CRISPR-Cas9可在多種植物中成功進行基因組定點編輯，包括小麥、番茄、大豆等，高通量基因組編輯技術最早應用在動物細胞中，且現在已成為基因篩選廣泛應用的方法，高通量基因組編輯技術在植物研究相對緩慢只有水稻和玉米中突變體庫，但在多倍體植物種沒有相關報道。

本實驗室已經初步建立起適用于棉花自身特點的相對高效的低脫靶率的基因組編輯載體系統，為我們進行棉花高通量突變體庫構建提供了技術支持。常規載體構建的方法只針對一個或幾個編輯位點，高通量突變體庫構建設計編輯位點多，常規方法需構建相同數量載體導致工作量多，因此獲得快速構建載體文庫的方法有重要意義，棉花(陸地棉)基因組復雜，轉化周期長，轉化效率低，這些因素導致建立棉花(陸地棉)全基因組基因編輯突變體庫可行性不強，但是針對某一性狀建立突變體庫是可行的，棉花是世界上重要的經濟作物之一，種植期間容易受到多種蟲害的影響，近年來，刺吸式昆蟲已經成為我國大部分棉花田最具破壞性的害蟲，因此針對陸地棉抗蟲性狀建立突變體庫篩選昆蟲免疫相關基因具有重要意義，對基因編輯突變體材料的基因編輯情況進行檢測是重要的環節之一，利用載體文庫侵染棉花獲得的不同突變體材料中的編輯位點及編輯水平多不相同，利用Sanger測序的方法進行檢測效率低，工作量大，費用高，因此結合高通量檢測技術對基因編輯突變體材料進行檢測的優勢突出。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了構建陸地棉抗蟲相關基因編輯突變體庫的方法，利用本發明構建的載體文庫混合侵染陸地棉下胚軸，通過遺傳轉化獲得陸地棉基因編輯突變體庫材料，用高通量的檢測方法對突變體材料進行檢測獲得基因編輯情況，針對棉花抗蟲性狀結合抗蟲鑒定結果篩選有表型的抗感蟲陸地棉基因。