本發(fā)明涉及穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶及人源CD20的小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20?hCD20(Tg)?mCD20(KO)?Luciferase細(xì)胞系構(gòu)建方法。該細(xì)胞系利用電轉(zhuǎn)將帶有Luciferase熒光素酶及人CD20基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和鼠CD20基因敲除的sgRNA共轉(zhuǎn)A20細(xì)胞系，得到穩(wěn)定表達(dá)人CD20及熒光素酶同時(shí)敲除細(xì)胞系自身鼠源CD20基因的A20細(xì)胞系。通過轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒上Neo抗性元件進(jìn)行篩選，獲得能穩(wěn)定傳代的單克隆，實(shí)現(xiàn)了熒光素酶及人CD20基因穩(wěn)定表達(dá)，鼠CD20基因敲除。本發(fā)明的細(xì)胞株為CD20為靶點(diǎn)的藥物的小鼠體內(nèi)藥效評估提供了可測量及可視化的模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞系的構(gòu)建，尤其基于基因編輯技術(shù)的穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶及人CD20敲除鼠CD20的小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase細(xì)胞系的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

淋巴瘤是發(fā)生于淋巴系統(tǒng)的全球最常見的十大惡性腫瘤之一，其在中國發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢，位居惡性腫瘤發(fā)病率前十位，死亡率高居前列。目前臨床中淋巴瘤具有分類復(fù)雜、異質(zhì)性高的特點(diǎn)，主要分為非霍奇金性淋巴瘤（彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、惰性淋巴瘤）及霍奇金性淋巴瘤，不同類型淋巴瘤的臨床治療策略均不相同，其中CD20作為表達(dá)在惡性B淋巴細(xì)胞表面的跨膜蛋白，參與B細(xì)胞的激活及分化。由于CD20在抗體結(jié)合后沒有內(nèi)化或下調(diào)，同時(shí)并不表達(dá)在前體B細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞中，不會影響正常B細(xì)胞的功能，因此成為目前臨床治療B細(xì)胞非霍奇金性淋巴瘤的理想靶點(diǎn)。

靶向CD20的單克隆抗體利妥昔單抗是第一個批準(zhǔn)用于臨床B細(xì)胞非霍奇金性淋巴瘤治療的人鼠嵌合抗體，單獨(dú)使用或與化療聯(lián)用開創(chuàng)了淋巴瘤免疫治療的新模式。其主要通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用ADCC和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用CDC等通過NK細(xì)胞及補(bǔ)體途徑發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。與此同時(shí)，二代靶向CD20抗體如ofatumumab、ocrelizumab、veltuzumab等多數(shù)處于臨床研究及前期研發(fā)階段，其更高水平人源化結(jié)構(gòu)（~90-100%）降低了一代抗體免疫原性較高引起的毒副作用，在淋巴瘤臨床治療中擁有廣泛的應(yīng)用前景?；贑D3和CD20的雙特異性抗體也是CD20靶點(diǎn)研發(fā)的又一重要方向，目前已在臨床評估中的mosunetuzumab和CD20-TCB在復(fù)發(fā)及難治的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤治療中表型出良好的療效，同時(shí)還能增加CAR-T療法的臨床患者響應(yīng)。這類基于CD3-CD20的雙特異性抗體作為紐帶一方面可以識別表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD3分子，同時(shí)識別表達(dá)在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面的CD20抗原分子，激發(fā)T細(xì)胞對CD20陽性淋巴瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。

目前已有的臨床前動物腫瘤建模模型無法滿足既擁有健全的免疫系統(tǒng)，又能直接評價(jià)CD20人源抗體通過作用于人源CD20蛋白的抗腫瘤作用。我們通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD20敲除鼠CD20基因修飾的A20細(xì)胞模型，結(jié)合BALB/c野生型小鼠及BALB/c人源化hCD3E小鼠可用于靶向CD20抗體及CD3-CD20雙特異性抗體的藥物研發(fā)。此外，通過在穩(wěn)定表達(dá)人CD20敲除鼠CD20基因修飾的A20細(xì)胞中過表達(dá)熒光素酶，可以借助活體成像系統(tǒng)觀察腫瘤細(xì)胞在動物體內(nèi)的生長轉(zhuǎn)移情況，為藥物的抗腫瘤效果評估提供了可視化的模型。因此，構(gòu)建基于穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶及人CD20敲除鼠源CD20的小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase的A20細(xì)胞系結(jié)合人源化小鼠可以彌補(bǔ)國內(nèi)外靶向CD20及CD3-CD20雙特異性抗體藥物臨床前評價(jià)模型的缺失。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中臨床前動物腫瘤模型的不足，本申請?zhí)峁┝艘环N構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源CD20和熒光素酶，敲除鼠源CD20基因修飾的A20細(xì)胞模型，該細(xì)胞模型結(jié)合BALB/c野生型小鼠及BALB/c人源化hCD3E小鼠可用于靶向CD20抗體及CD3-CD20雙特異性抗體的藥物藥效的評價(jià)，同時(shí)可以借助活體成像系統(tǒng)觀察腫瘤細(xì)胞在動物體內(nèi)的生長轉(zhuǎn)移情況，為以CD20為靶點(diǎn)的藥物的小鼠體內(nèi)藥效評估提供了皮下可測量及體內(nèi)轉(zhuǎn)移可視化的模型。