一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒含有：（a）一抗：GPC3單克隆抗體工作液，所述GPC3單克隆抗體為鼠源GPC3抗體或人源GPC3抗體；（b）二抗：HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體工作液；（c）DAB顯色液A緩沖液和DAB顯色液B緩沖液；（d）蘇木素細胞染色液；（e）組織抗原修復(fù)液；（f）2?3％體積比的H₂O₂；本發(fā)明涉及的檢測試劑盒具有高靈敏性，高特異性和高準(zhǔn)確性的特點，不僅可以區(qū)分癌變組織和正常組織，還可以區(qū)分癌變組織中癌變的細胞和正常的細胞；GPC3在正常肝細胞中呈陰性表達染色，而在癌變細胞細胞漿和細胞膜中呈陽性表達，有效地區(qū)分肝癌變細胞和正常細胞，為臨床的診斷和治療提供參考依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與體外血清學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒及其應(yīng)用，通過建立可以用于臨床病理診斷的試劑盒，來驗證該抗體的臨床適用性。

背景技術(shù)

肝細胞癌(hepatocellular Carcinoma，HCC)是目前全世界發(fā)病率很高的第五大癌癥，我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。目前外科手術(shù)切除腫瘤仍是治療HCC最好、最快捷的方法。然而，大多數(shù)患者就診時已失去了最佳治療時機，能夠早期手術(shù)切除者只占10-20％，即使手術(shù)切除，復(fù)發(fā)率仍很高。所以早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療HCC是提高患者生存率的關(guān)鍵，也是預(yù)后和治療的關(guān)鍵。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，其基因位于人染色體X26q1,長900kb，GPC3開放閱讀框有1740bp,編碼580個氨基酸，分子量為66kD。GPC3基因編碼的蛋白屬于硫酸已酰肝素蛋白聚糖(Heparan Sulfate Proteoglycans，HSPGs)，通過糖基磷脂酰蛋白(glycosyl-phosphatidylinositol Anchor,CPI)錨定在細胞表面，可結(jié)合生長因子等，調(diào)控著細胞生長、繁殖、分化、黏附和遷移等行為。

研究證實GPC3蛋白在肝癌組織中高表達，而在非癌組織中沒有表達或表達極少，并能在血清中檢測到GPC3的含量，用免疫組化的方法檢測肝癌患者的GPC3陽性率在90％以上，而其他良性肝病和正常肝組織中表達率為極低，其特異性能達到96％以上。另外，GPC3在對于HCC在血清中的檢出率明顯高于AFP，兩者分別是76.3％和31.3％。因此，GPC3對HCC的診斷率明顯高于AFP，尤其在AFP陰性的早期肝癌的診斷中發(fā)揮重要作用。

GPC3作為一種新的生物學(xué)指標(biāo)，目前臨床上暫時沒有針對其的檢測方法，在監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用還屬空白，而之所以這個空白很難突破，在于GPC3蛋白很難通過體外重組方式進行表達，更會影響抗體的制備，我們構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達GPC3蛋白的細胞系，用該細胞系表達的蛋白進行免疫小鼠，篩選制備出可以表達效價較高的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。由于雜交瘤細胞有丟失高特異性高活性的風(fēng)險，或者細胞狀態(tài)不好乃至死亡。而經(jīng)過雜交瘤測序，可以獲得相應(yīng)的序列，可以以重組蛋白的方式來穩(wěn)定獲得抗體；從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細胞為載體保留該抗體，而可以以堿基序列的形式進行保存和傳播交流、鑒定。我們將該GPC3單克隆抗體克隆株進行測序處理加工修飾后，再通過構(gòu)建的人源化抗體重組表達載體，在公司驗證的穩(wěn)定細胞系進行抗體的大量表達。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒及其應(yīng)用，要解決現(xiàn)有技術(shù)肝癌診斷不靈敏的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有：

(a)一抗：GPC3單克隆抗體工作液，所述GPC3單克隆抗體為鼠源GPC3抗體或人源GPC3抗體，兩種抗體皆為本實驗室制備；

(b)二抗：HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體工作液；