[發明專利]一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒及其應用在審

申請號：	202010596422.5	申請日：	2020-06-28
公開（公告）號：	CN111751534A	公開（公告）日：	2020-10-09
發明（設計）人：	李偉;趙樹杰	申請（專利權）人：	南京拂曉生物科技有限公司
主分類號：	G01N33/577	分類號：	G01N33/577;G01N33/574;C07K16/30;C07K16/28
代理公司：	北京中建聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11004	代理人：	旦帥男;王靈靈
地址：	210046 江蘇省***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖檢測試劑盒及其應用
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【權利要求書】：

1.一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有：

（a）一抗：GPC3單克隆抗體工作液，所述GPC3單克隆抗體為鼠源GPC3抗體或人源GPC3抗體；

（b）二抗：HRP標記羊抗鼠IgG抗體工作液；

（c）DAB顯色液A緩沖液和DAB顯色液B緩沖液；

（d）蘇木素細胞染色液；

（e）組織抗原修復液；

（f）2-3％體積比的H₂O₂。

2.如權利要求1所述的一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒，其特征在于，所述鼠源GPC3抗體的制備方法包括如下步驟：

(a)動物免疫：通過親和層析和離子交換層對GPC3蛋白進行純化后，濃縮至5mg/ml，將GPC3蛋白抗原與弗氏佐劑等體積混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多點免疫BALb/c小鼠，0.2mg/只，0天免疫為弗氏完全佐劑，末次免疫一周后采血，通過間接ELISA檢測抗體效價，末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔沖擊選定的小鼠即為備用融合小鼠；

（b）細胞融合：復蘇培養SP2/0細胞株，融合前3天擴大培養，融合前1天去除RPMI1640細胞培養液，重新添加培養液，取步驟（a）中選用的備用融合小鼠的脾細胞制備小鼠脾細胞懸浮液和本實驗室保存的SP2/0細胞進行融合；

（c）單克隆抗體的大量制備：ELISA法測定上清液選取陽性高的孔，將陽性孔細胞轉入24孔板進行擴大培養，并及時進行亞克隆經3次亞克隆得到穩定分泌抗體的細胞系；獲得細胞免疫小鼠的腹水，純化后得到GPC3單克隆抗體。

3.如權利要求2所述的一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒，其特征在于，所述動物免疫具體包括：GPC3蛋白純化后，監測波長為280nm，收集洗脫峰，取少量洗脫蛋白液做電泳分析，其余用0.85%的NaCl溶液在4℃透析48h，之后用超濾膜濃縮至5mg/ml，將磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白抗原與弗氏佐劑等體積混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多點免疫Balb/c小鼠，0.2mg/只，末次免疫一周后采血，間接ELISA檢測血清中抗體效價，血清稀釋104倍時OD值為1.089,于末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔沖擊選定的小鼠，3天后取小鼠脾臟，進行細胞融合。

4.如權利要求2所述的一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒，其特征在于，所述細胞融合具體包括：

復蘇SP2/0細胞株和準備小鼠脾細胞懸液：細胞融合前復蘇培養SP2/0細胞株，融合前3天擴大培養，融合前1天去除RPMI1640細胞培養液，重新添加培養液，SP2/0細胞準備完成；處死免疫小鼠，按常規方法制備小鼠脾細胞懸液；

細胞混勻準備：脾細胞與SP2/0細胞計數結果分別加入適量不完全IMDM培養液，SP2/0細胞晃動混勻，脾細胞用移液管吹打均勻，然后將脾細胞與SP2/0細胞按1:2合于50ml離心管中，混勻，再加不完全MDM培養液至50ml，離心5鐘，倒凈上清，輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻，離心管置37°C水浴，準備融合；

細胞融合：將37°C預熱的50%的PEG4000lml，用滴管緩慢滴入混合細胞管，邊滴邊轉動離心管，使細胞保存在混勻狀態，靜置90s后立即緩慢加入15ml37°C無血清的MDM培養基，然后離心5鐘，棄去上清，再加入MDM完全培養液，混勾，將混懸液分別加至96孔細胞培養板中，100ul/孔，于37°C培養箱內培養，次日細胞板加HAT培養液100ul/孔，每3天換一次HAT培養液，觀察是否出現雜交瘤，兩周后換HT培養基，觀察融合細胞生長狀況。

5.如權利要求1~4任意一項所述的一種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3檢測試劑盒的應用，其特征在于，用于臨床肝癌診斷。

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