本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及用于培養(yǎng)MDCK細(xì)胞系的培養(yǎng)基及其制備方法，包括基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物類、微量元素類、維生素類、鹽類、脂質(zhì)體、添加物等。制備方法簡單，成本低，便于操作。制得的培養(yǎng)基能支持MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，促進(jìn)MDCK細(xì)胞生長，而且安全性好，培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系可應(yīng)用于禽流感疫苗的生產(chǎn)中。

背景技術(shù)

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza）是由甲型流感病毒的亞型(也稱禽流感病毒）引起的一種急性傳染病，能夠感染人類，且人感染禽流感后的死亡率在30％以上。目前為止禽流感仍未找到理想的治療藥物，疫苗接種仍是當(dāng)今防止疫病發(fā)生和流行的最有效手段。

禽流感疫苗的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是雞胚培養(yǎng)法，這種以雞胚作為生產(chǎn)基質(zhì)的方式已使用多年，工藝成熟，但生產(chǎn)周期長、操作繁瑣、工作量大、易污染，如遇禽流感大規(guī)模爆發(fā)，雞胚的供應(yīng)存在很大問題。以細(xì)胞作為介質(zhì)是目前疫苗制備的趨勢(shì)，犬腎(Madin-Darbycanine kidney cells，MDCK）細(xì)胞由Madin和Darby分離培育建立，培養(yǎng)容易、增殖快、流感病毒感染效率高，是國內(nèi)外公認(rèn)的最適合禽流感病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系。其通常是以貼壁培養(yǎng)生長，細(xì)胞之間互相銜接或呈鑲嵌狀排列，并會(huì)在表面集合形成緊密的連接蛋白，從而形成單層貼壁細(xì)胞。

但是，該培養(yǎng)方式存在一些缺陷，比如貼壁培養(yǎng)受基質(zhì)表面積限制導(dǎo)致病毒產(chǎn)量下降；貼壁培養(yǎng)過程中換液等程序較為復(fù)雜繁瑣，血清的使用易受微生物、病毒和支原體等的污染，即使無血清貼壁培養(yǎng)也只適用于試驗(yàn)研究，不適用于大規(guī)模培養(yǎng)，不能滿足病毒疫苗等實(shí)際生產(chǎn)需要。

無血清培養(yǎng)技術(shù)是闡明細(xì)胞生成、增殖、分化以及基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)問題的有效工具。與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基組成成分相對(duì)清楚，制備過程簡單，在現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來，對(duì)無血清培養(yǎng)基的研究已取得了一些長足的進(jìn)展：Taub等人開發(fā)出了MediumK-1無血清培養(yǎng)基，以SF-DMEM/F12（1:1）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加多種激素和抗生素，其能支持貼壁MDCK細(xì)胞生長，每天增殖1.5倍。美國Sigma-Aldrich公司開發(fā)了無血清培養(yǎng)基MDCK-LP和MDCK-LPM，它們適于MDCK細(xì)胞的貼壁生長和乙肝病毒疫苗的生產(chǎn)。英國應(yīng)用微生物研究中心用Gibco無血清商業(yè)培養(yǎng)基EpiSerf培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒疫苗，其病毒滴度為1.0×10⁹病毒空斑形成單位/毫升。然而，諸如上述國外推出的支持MDCK細(xì)胞生長的商業(yè)培養(yǎng)基成分不明，價(jià)格昂貴，不便于大規(guī)模使用。目前國內(nèi)適于MDCK細(xì)胞擴(kuò)大化全懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基研究不多，因此有必要開發(fā)克服現(xiàn)有MDCK細(xì)胞培養(yǎng)基缺點(diǎn)、適用于大規(guī)模生產(chǎn)的MDCK細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，建立針對(duì)MDCK細(xì)胞的優(yōu)化的無血清懸浮培養(yǎng)工藝。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于培養(yǎng)MDCK細(xì)胞系的培養(yǎng)基，特別是用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能支持MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，促進(jìn)MDCK細(xì)胞生長，而且安全性好，培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系可應(yīng)用于禽流感疫苗的生產(chǎn)中。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于培養(yǎng)MDCK細(xì)胞系的培養(yǎng)基的制備方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，采用如下技術(shù)方案：一種用于培養(yǎng)MDCK細(xì)胞系的培養(yǎng)基，其特征在于，各組分的濃度以mg/L計(jì)為：

基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物類：所述基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物類為絲氨酸5-55、鹽酸精氨酸20-250、亮氨酸20-55、異亮氨酸20-55、酪氨酸20-55、丙氨酸2-10、天冬酰胺2-25、天冬氨酸2-25、鹽酸半胱氨酸5-55、谷氨酸2-50、組氨酸5-55、賴氨酸20-250、苯丙氨酸10-55、蘇氨酸5-55、色氨酸5-25、纈氨酸20-250；

核苷酸類：所述核苷酸類為次黃嘌呤2-20、胸苷2-5、腺苷2-5、尿苷2-5；