本發(fā)明提供了一種殼聚糖修飾的納米酶黏膜免疫佐劑及流感黏膜疫苗及其制備方法，屬于疫苗技術領域。殼聚糖修飾的納米酶可通過酶催化方式激活樹突狀細胞ROS水平進而增強天然免疫水平，具有顯著的黏膜免疫佐劑特性，而且還能增加流感病毒黏附黏膜的數(shù)量和延長黏附時間。將殼聚糖修飾的納米酶交聯(lián)滅活流感病毒滴鼻免疫后，顯著增強針對流感病毒特異性黏膜免疫和全身系統(tǒng)性免疫水平，具有顯著的抗原靶向黏膜遞送能力和黏膜佐劑特性，所制備的黏膜疫苗，通過兩次滴鼻免疫后可完全保護小鼠對流感病毒的致死性攻擊，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于疫苗技術領域，具體涉及一種殼聚糖修飾的納米酶黏膜免疫佐劑及流感黏膜疫苗及其制備方法。

背景技術

流行性感冒簡稱流感(Influenza)，是由流感病毒(Influenza virus)引起的一種人畜共患傳染病。流感病毒可分為A型、B型和C型流感病毒，其中A型流感病毒對人類的威脅最大[1]。該病毒主要通過呼吸道傳播，歷史上流感病毒的大流行給全世界各國人民造成了人員和經濟上的巨大損失。1917年-1919年歐洲暴發(fā)的西班牙流感(病毒亞型H1N1)疫情，造成5000萬人死亡，是歷史上最嚴重的流感疫情[2]。目前預防和控制流感病毒最常用的方法是肌肉注射流感病毒滅活疫苗，包括全病毒滅活流感疫苗和裂解滅活流感疫苗。但是肌肉注射接種疫苗不能在黏膜部位誘導特異性SIgA抗體，并且容易在接種部位產生炎癥和形成肉芽腫。鼻腔是流感病毒進入機體的主要入口，如果在鼻腔和上呼吸道建立有效的黏膜免疫保護，將有效阻止流感病毒的入侵，將病毒阻滯在早期階段，該黏膜免疫策略也可提高交叉保護水平，特別是針對流感病毒多亞型多分支的現(xiàn)狀，黏膜免疫可依據(jù)“共同黏膜免疫系統(tǒng)”的理論，在消化道和生殖道等其它黏膜面建立黏膜免疫保護，可有效阻斷流感病毒從其它途徑入侵和散播。全病毒滅活流感疫苗雖然具有較高的安全性[3]，但是它不能在鼻腔黏膜上皮細胞中繁殖，所以單獨應用滅活流感疫苗通過鼻腔免疫不能誘導有效的免疫應答。因此亟需開發(fā)具有抗原遞送能力高和免疫刺激能力強等多重功能的黏膜免疫佐劑。

鼻腔黏膜免疫可以阻斷流感病毒的入侵，但是由于滅活H1N1流感病毒和鼻腔黏膜均帶負電荷，所以滴鼻免疫滅活H1N1流感病毒后，病毒粒子在鼻腔黏膜處停留時間很短，加之滅活的H1N1流感病毒不能在鼻腔黏膜上皮細胞中增殖，嚴重限制了抗原遞送量，導致單獨應用滅活H1N1流感病毒進行鼻腔免疫頻頻失敗。盡管現(xiàn)有研究選用了霍亂毒素(CT)作為黏膜佐劑，但安全性問題始終無法解決。也有人選用Toll-like激動劑如CpG等，但該類佐劑成本較高，而且功能往往單一，難以同時解決黏膜疫苗諸多問題，較難實現(xiàn)應用。

Fe₃O₄納米酶(Iron oxide nanozyme，IONzyme)是新近開發(fā)的納米制劑，被廣泛應用于蛋白質與核酸的分離純化、細胞標記、腫瘤治療以及核磁共振成像[4-6]。Fe₃O₄納米酶可模擬多種類酶活性，如過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，納米酶具有調節(jié)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的能力[8]，IONzyme在酸性條件下，具有類過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，有利于胞內ROS的產生。而ROS的活化有助于樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)成熟[9]，提高天然免疫水平[10]。但IONzyme在黏膜佐劑的應用中還沒有相關報道。

參考文獻：

[1]甘孟侯.禽流感:第二版[M].中國農業(yè)出版社,2002.

[2]孫波.流行性感冒危害及接種流行性感冒疫苗的研究.預防醫(yī)學與公共衛(wèi)生[J].2016,13(4):76-78.

[3]吳俊東,朱鳳才.流感疫苗研究的進展.江蘇預防醫(yī)學[J].2008,19(2):83-85.