海水中海地瓜幼體生物量的檢測統計方法包括：提取海地瓜成體DNA，測序得到COⅠ基因序列；以PCR產物為起始標準品制作4個濃度梯度的標準品；設計熒光定量PCR特異性引物并驗證，通過后得到CT值?DNA濃度對數值的標準曲線；取不同干重海地瓜組織提取DNA，以不同干重的海地瓜組織的DNA為模板進行熒光定量PCR定量測試，得到DNA質量與海地瓜組織干重的趨勢直線方程；測出待測海水樣品中DNA的CT值，將CT值帶入海地瓜組織干重?CT值推導關系式得到海地瓜幼體DNA的濃度值，計算得到所含海地瓜幼體的DNA質量；通過干濕重比例及推導關系式計算出海地瓜幼體的濕重。

技術領域

本發明屬于浮游生物的生物量統計領域，尤其涉及一種核電站海水域海地瓜幼體生物量的統計方法。

背景技術

海地瓜(Acaudina spp)，隸屬棘皮動物門(Echinodermata)，海參綱(Holothuroidea)，海參亞綱，芋參目(Molpadida)，尻參科(Caudinidae)，海地瓜屬(Acaudina)。該屬有兩個種——白肛海地瓜(Acaudina leucoprocta H.L.Clark)和海地瓜(Acaudina molpadioidea Semper)。俗稱海茄子，盛產于亞熱帶沙質海區，日本、菲律賓、印度尼西亞，我國海南、廣東、福建、浙江沿海均有。目前對于海地瓜的研究主要集中在海地瓜的營養價值、藥用價值以及生理功能方面，對海地瓜的生物量統計的報道較少，唐婭菲等研究表明海地瓜在核電站附近海域能夠引起核電站發生堵塞取水系統從而影響取水安全的事件，對核電站的運行安全存在一定的威脅作用。針對核電站運行而言，海地瓜是一種致災生物，因此對其生物量的估算可以有效的采取措施控制海地瓜的數量，從而保障核電站的健康運行。

目前浮游生物的估算方法主要有：血球計數法、分光光度計法、干重測量法、流式細胞法等。目前對浮游生物的生物量統計主要是針對某一類，按直徑大小，還比較缺少針對海域某一種浮游生物的生物量的估算方法。

發明內容

本發明針對現有技術存在的問題和不足，提供一種海水中海地瓜幼體生物量的檢測統計方法，解決了針對某一海域中海地瓜幼體生物量的估算難題，能夠較為快速、準確的估算出某一海域海地瓜幼體的生物量，同時也能為其他水生生物幼體的估算提供參考。

本發明是通過下述技術方案來解決上述技術問題的：

本發明提供一種海水中海地瓜幼體生物量的檢測統計方法，其特點在于，其包括以下步驟：

S1、使用《海洋動物基因組DNA提取試劑盒》提取海地瓜成體DNA，設計海地瓜成體DNA中COⅠ基因的引物，使用COⅠ基因的引物進行PCR擴增，測序得到COⅠ基因序列，將COⅠ基因序列進行Blast比對，鑒定出該COⅠ基因序列為海地瓜的COⅠ基因序列；

其中，COⅠ基因的引物序列為：

上游序列：GACATGGCTTTCCCACGAATG

下游序列：GCTCGTGTGTCTACGTCCA

PCR擴增時，其退火溫度為53℃；

S2、以步驟S1得到的PCR產物為起始標準品，制作4個濃度梯度10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的標準品；

S3、根據測序得到的海地瓜COⅠ基因序列，設計熒光定量PCR特異性引物，并驗證引物特異性，驗證通過后，再通過熒光定量PCR絕對定量得到CT值-DNA濃度對數值的標準曲線及對應的直線方程；

熒光定量PCR特異性引物序列為：

上游序列：GAGGTGTGGGTACAGGATGA

下游序列：CTTAGTAAGAGGAGGAAGGCGG