本發(fā)明提供一種卵巢濾泡膜干細胞及其分離方法、培養(yǎng)方法和應用，涉及干細胞與組織工程技術領域。卵巢濾泡膜干細胞的分離方法，包括以下制備方法：獲取卵巢組織：從生育力和卵巢功能正常，年齡為4～10歲的雌性食蟹猴，獲取卵巢組織，剝離卵巢組織周圍脂肪，保留卵巢皮質基質，清洗，將卵巢皮質基質剪成組織碎塊；培養(yǎng)：向組織碎塊中加入培養(yǎng)基，離心，棄掉上清液，加入培養(yǎng)液重懸，孵育，離心，棄掉上清液，加入培養(yǎng)液重懸，得到細胞懸液，接種培養(yǎng)，即得卵巢濾泡膜干細胞。本發(fā)明的方法可以成功分離卵巢濾泡膜干細胞，可以分化為卵巢濾泡膜細胞，可以提高血清AMH水平，提升卵巢功能。

技術領域

本發(fā)明涉及干細胞與組織工程技術領域，特別是涉及一種卵巢濾泡膜干細胞及其分離方法、培養(yǎng)方法和應用。

背景技術

隨著生育年齡推遲，生活壓力及環(huán)境因素影響，由性腺衰老導致的不孕不育現象明顯增多。過去十年，我國育齡人群的不孕不育率已達到15％左右，每8對育齡夫婦中就有1對不孕不育患者。二孩政策的放開也給生殖健康帶來了新的挑戰(zhàn)：50％可生育二孩的女性年齡超過40歲高齡，導致生育力嚴重下降。同時卵巢衰老也直接加劇了人體的衰老速度。因此，如何有效治療卵巢衰老，延緩機體衰老是我們面臨的重要議題。生育力的核心之一是生殖細胞，它們也是生育力環(huán)節(jié)中最為重要的種子。同時，生殖細胞并不是孤立的，性腺體細胞增殖分化及激素分泌等功能的存在是維持生殖細胞正常發(fā)育的重要保障，因此，欲延緩衰老和重建生育力，為生殖細胞提供一個適宜發(fā)育的土壤微環(huán)境，也是至關重要的環(huán)節(jié)。

卵巢功能低下等系列疾病體現為卵子數量減少和/或質量低下、排卵障礙、不孕和生殖內分泌紊亂等問題，卵巢功能疾病主要包括卵巢早衰(premature?ovarian?failure，POF)、卵巢儲備功能降低(diminished?ovarian?reserve，DOR)、早發(fā)性卵巢功能不全(premature?ovarian?insufficiency，POI)和卵巢低反應(poor?ovarian?response，POR)等。以卵巢早衰為例，該疾病的誘因較為復雜，目前尚未完全清楚，已知影響因素主要包括：遺傳學因素(如脆性X染色體等)、激素合成的相關代謝酶缺乏、蛋白及受體缺陷、免疫因素、感染因素、化療放療等醫(yī)源性因素，這些因素往往加速卵泡閉鎖。卵巢早衰的治療方式主要是激素替代療法、低溫凍存卵子、卵巢移植、免疫療法乃至心理治療法等，這些治療方式也存在一定的風險及副作用，目前沒有特效的治療方式，因此亟待尋求新的治療方式。

卵巢濾泡膜細胞(theca?cell，TC)是一群與雄性睪丸中分泌雄激素的睪丸間質細胞類似的細胞類型，是卵巢中合成雄激素的主要來源，產生的雄激素轉運至顆粒細胞作為合成雌激素的底物，因此該細胞有可能成為治療卵巢功能低下等系列疾病的種子細胞。卵巢濾泡膜干細胞(thecal?stem?cell，TSC)是一群具有自我更新能力的細胞類型，可分化為TC。目前對TSC的研究甚少，由于生物體內的TSC來源不明確，在卵巢中數量有限，已有報道從小鼠和豬全卵巢中可以分離得到TSC。靈長類動物與人類親緣關系更為接近，其卵巢結構及生理周期與人類似，但其TSC的分離尚未見報道。已有的TSC的獲取大多采用全卵巢分離的方式，損傷較大，也不利于開展自體移植治療。

而本專利可采用微創(chuàng)獲取猴卵巢皮層少量組織的方式，分離獲得了TSC，并通過改良培養(yǎng)條件大量擴增該細胞并驗證其功能，為后續(xù)該細胞的基礎研究及臨床轉化應用研究提供研究基礎，為進一步推動人類卵巢功能低下等疾病的治療具有重要意義。

發(fā)明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種卵巢濾泡膜干細胞的分離方法，可以成功分離出猴卵巢濾泡膜干細胞，該細胞具有再生修復病損組織的功能。

一種卵巢濾泡膜干細胞的分離方法，包括以下制備方法：

獲取卵巢組織：選擇年齡為4～10歲的雌性食蟹猴，從生育力和卵巢功能正常的食蟹猴卵巢獲取卵巢組織，剝離卵巢組織周圍脂肪，保留卵巢皮質基質，清洗，將卵巢皮質基質剪成組織碎塊；