本發明屬于病毒檢測的生物技術領域，具體涉及一種用于新冠肺炎病毒SARS?CoV?2核酸檢測試劑盒及其檢測方法。所述試劑盒包括基于Cpf1的膠體金試紙條檢測體系；所述檢測方法包括如下步驟：a)制備新冠病毒核酸樣品；b)取步驟a)得到的核酸樣品，利用病毒核酸orf1a、orf1a、N和E基因片段的特異性引物，加入RT?RPA等溫擴增體系，擴增獲得特異性產物；c)將步驟b)得到的特異性產物加入Cpf1檢測體系，反應得到Cpf1檢測產物；d)將Cpf1檢測產物進行膠體金試紙條檢測。本發明通過利用Cpf1特異識別核酸和膠體金試紙條檢測技術，實現對新冠病毒核酸的高靈敏度、高特異性及快速可視化檢測。

技術領域

本發明屬于病毒檢測的生物技術領域，具體涉及一種用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

國際病毒分類委員會(ICTV)將新型冠狀病毒(2019-nCoV)的正式分類名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。世界衛生組織(WHO)宣布，由這一病毒導致的疾病的正式名稱為COVID-19，該病毒與嚴重的急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)相似。SARS-CoV-2(ssRNA+)是具包膜RNA冠狀病毒(sarbecovirus亞屬，Orthocoronavirinae亞科)的第七個成員。

目前，對于新冠肺炎的診斷主要有病毒核酸分子檢測和胸部影像學檢測兩種。胸部影像學檢測，主要依賴于胸肺部CT成像結果進行判斷：早期呈現多發的小斑片影及間質改變，以肺外帶明顯，進而發展為雙肺多發磨玻璃影、浸潤影。嚴重者出現肺實變，甚至‘白肺’，胸腔積液少見。但是，胸肺部CT檢測，需要依賴于專業。在分子生 物學的手段上，目前常用的辦法有兩種：病毒的基因測序和核酸檢測。二代測序因為可以檢測微量物質，但是大多數醫院沒有測序的設備和生物信息團隊來協助，并且成本高檢測周期也比較長，不適合做篩查。

現在的診斷方法以來病毒核酸檢測：通過實時反轉錄聚合酶鏈式反應(realtimereverse transcrition PCR，rRT-PCR)鑒定。每個病例采集上、下呼吸道標本，如支氣管和肺泡灌洗液、深咳痰液，同時采集發病初期和發病14天后的血清。目前在符合疑似病例標準的基礎 上，對痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等標本進行rRT-PCR檢測， 顯示SARS-CoV-2核酸陽性，即可確診SARS-CoV-2感染。rRT-PCR檢測病毒核酸主要受制于：試劑盒質量和能夠承擔臨床檢測的P3實驗室數量、P3實驗室設備的準確性和穩定性、能進行熟練穩定操作的工作人員人數、需要一些昂貴的實驗設備、并且檢測時間較長。

目前，尚沒有針對SARS-CoV-2感染有效治療手段或疫苗，疾病 控制主要依賴于嚴格的物理隔離切斷傳播途徑，從而直接造成嚴重的經濟損失，鑒于SARS-CoV-2傳播途徑廣泛和傳播速度快，迫切需要病毒的快速診斷，這對于預防和確診該病非常重要。實現SARS-CoV-2準確快速的檢測，使得防疫檢疫決策可以當機立斷、立即處置，達到 阻斷擴散風險的目的。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是細菌中一種適應性免疫系統，Cas蛋白通過RNA引導的核酸酶靶向降解外來核酸。其中，CRISPR-Cas12a(Cpf1)屬于Cas酶第二家族，用來引導RNA指導雙鏈DNA裂解單個RuvC 催化結構域。Cpf1酶識別富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的間隔區相鄰基序(PAM)，催化它們自身的指導CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特異性識別和切割互補配對的雙鏈DNA(dsDNA)，當CRISPR/Cpf1蛋白以序列特異性方式識別切割靶雙鏈DNA時，能誘 導強大的非特異性單鏈DNA(ssDNA)反式切割活性。