[發明專利]一種用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的檢測試劑盒及其檢測方法有效
| 申請號： | 202010113049.3 | 申請日： | 2020-02-24 |
| 公開（公告）號： | CN111521781B | 公開（公告）日： | 2021-07-30 |
| 發明（設計）人： | 劉明;王鑫杰;鐘名天 | 申請（專利權）人： | 廣州醫科大學附屬第一醫院（廣州呼吸中心） |
| 主分類號： | G01N33/569 | 分類號： | G01N33/569;G01N33/558;G01N33/543;C12Q1/6844 |
| 代理公司： | 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493 | 代理人： | 王允輝 |
| 地址： | 510120 *** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 用于 肺炎 病毒 sars cov 核酸 檢測 試劑盒 及其 方法 | ||
1.一種用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括基于Cpf1的膠體金試紙條檢測體系；
所述基于Cpf1的膠體金試紙條檢測體系包括針對新冠病毒SARS-CoV-2核酸的特異性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA報告系統；
所述特異性crRNA包括針對orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2，針對orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2，針對N基因的N-cr1到N-cr2和針對E基因的E-cr1到E-cr2；
所述特異性crRNA的基因序列分別為SEQ NO.1到SEQ NO.8；
所述orf1a基因、orf1b基因、N基因和E基因的序列分別為SEQ NO.9到SEQ NO.12；
所述ssDNA報告系統采用包括地高辛和生物素標記的ssDNA，標記產物為/5Dig/TTTATTA/3Bio/，命名為ssDNA DB reporter /5Dig/TTTATTA/3Bio/，用于膠體金試紙條檢測。
2.由權利要求1所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述特異性crRNA的制備方法包括如下步驟：針對SARS-CoV-2病毒基因片段orf1a、orf1b、N和E，找到包含Cpf1識別序列TTTN的靶向序列，設計23bp長度的crRNA，通過體外轉錄或者合成獲得特異性crRNA。
3.由權利要求1所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述Cpf1蛋白的制備方法包括如下步驟：針對Cpf1蛋白進行原核密碼子優化獲得序列SEQNO.13，構建到pET28a表達載體，進行低溫誘導可溶蛋白表達，通過親和純化和分子篩純化獲得目的蛋白。
4.一種用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸檢測的試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
a）制備新冠病毒SARS-CoV-2核酸樣品；
b）等溫擴增核酸：取步驟a）得到的核酸樣品，利用SARS-CoV-2病毒核酸orf1a、orf1a、N和E基因片段的特異性引物，所述特異性引物的基因序列如SEQ NO.14~ SEQ NO.21所示，加入RT-RPA等溫擴增體系，擴增獲得特異性產物；
c）Cpf1檢測反應：將步驟b）得到的特異性產物加入Cpf1檢測體系，反應得到Cpf1檢測產物；
d）將Cpf1檢測產物進行權利要求1至3任一項所述試劑盒的膠體金試紙條檢測。
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