本發明公開了一種鑒別糙海參卵巢發育期雌參個體的方法。抽取糙海參的體腔液，然后離心分離出卵黃蛋白，再經SDS?PAGE電泳和染色，通過電泳結果將卵巢發育期的雌參、雄參以及性腺未發育的糙海參區別開來。卵巢發育期雌參個體樣品呈現200?250kD的特征條帶，而性腺未發育個體和雄參個體樣品均無出現該特征條帶。本發明可以在不損傷糙海參的情況下，通過抽取體腔液樣品鑒別卵巢發育期雌參個體，對于人工育苗時親參的選取具有應用價值。

技術領域

本發明屬海水養殖生物技術領域，具體涉及一種鑒別糙海參卵巢發育期雌參個體的方法。

背景技術

糙海參(Holothuriascabra)又名白參、沙參，隸屬棘皮動物門、海參綱、枝手亞綱、楯手目、海參科、海參屬。分布于西從納塔耳港到紅海、向東到加羅林群島、斐濟群島、向北到日本、向南到澳大利亞以及中國大陸的廣西、廣東、海南等地，一般生活于岸礁邊緣以及潮流強和海草多的沙底。糙海參體壁較厚，具有豐富的膠原蛋白，口感爽滑富有彈性，不但具有很高的營養價值，而且還具有極高的藥用價值。糙海參是一種重要的熱帶海參養殖品種和出口創匯的高檔水產品。它具有生長迅速、養殖方式簡單多樣、病害少、市場需求量大等特點，在我國華南沿海地區具有極大的養殖開發潛力。

我國華南地區糙海參的繁殖期在每年5-9月，通常通過陰干、流水刺激法對親參進行人工催產。只有精巢發育的雄參和卵巢發育的雌參可用于人工催產，其中卵巢發育的雌參較難獲得。卵巢發育的雌參個體在外觀上與性腺未發育的個體及雄參個體均無差別，給糙海參的人工繁育時親參的選取帶來困難。因此，亟需開發一種可以在不損傷海參的條件下將卵巢發育期的雌參鑒別出來的方法。

超速離心沉降法是指利用離心力的作用將分散體系中的分散質點逐漸沉降，從而分離的方法。溶液中的顆粒在受到強大的離心作用時，如果顆粒密度大于溶劑密度，顆粒就會下沉。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒別糙海參卵巢發育期雌參個體的方法，利用本發明的方法能夠鑒別糙海參卵巢發育期雌參個體，從而可以在不損傷糙海參的情況下，通過抽取體腔液樣品鑒別卵巢發育期雌參個體，對于人工育苗時親參的選取具有應用價值。

本發明發現卵巢發育期的雌參體腔液中富含卵黃蛋白，而性腺未發育的個體及雄參個體均不含有該蛋白。但由于體腔液中還含有與卵黃蛋白分子量接近的雜蛋白，因此，難以通過SDS-PAGE蛋白電泳直接鑒定體腔液中的卵黃蛋白。卵黃蛋白是一種載脂蛋白，與脂類形成脂蛋白復合體。本發明通過超速離心方法，可以首先將脂蛋白(卵黃蛋白)和其他非脂結合的雜蛋白分離開來，從而去除先前在SDS-PAGE蛋白電泳中與卵黃蛋白分子量相近的雜蛋白。然后取脂蛋白進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，通過電泳結果將卵巢發育期的雌參、雄參以及性腺未發育的糙海參區別開來。

因此，本發明的鑒別糙海參卵巢發育期雌參個體的方法，包括以下步驟：

抽取糙海參的體腔液，然后離心分離出卵黃蛋白，再經SDS-PAGE電泳和染色，通過電泳結果將卵巢發育期的雌參、雄參以及性腺未發育的糙海參區別開來。具體是在200-250kDa處有明顯條帶的為卵巢發育期雌參個體，而性腺未發育個體和雄性個體均不具備該特征條帶，由此鑒別出糙海參卵巢發育期雌參個體。

優選，所述的離心分離出卵黃蛋白是通過超速離心分離出卵黃蛋白。糙海參的體腔液經高速離心后，其卵黃蛋白位于上清液的上部，吸取上清液的上部即可獲得分離出的卵黃蛋白。具體方案為：將含有濃度為1mM PMSF、密度為1.215g/mL的KBr的溶液4mL加入超速離心管底部，將1mL糙海參的體腔液加入超速離心管上部，在Himac CP 100MX超速離心機，使用P100AT-0132轉子，以180,000g轉速、10℃離心24h，取上部300μL液體，即為包含卵黃蛋白的溶液。

所述的染色是考馬斯亮藍染色。

優選，所述的抽取糙海參的體腔液是用預先加入蛋白酶抑制劑PMSF溶液的注射器穿過糙海參體壁，插入到達體腔，抽取體腔液。