本發明屬于生物技術領域，具體涉及MAP3K8基因敲除PK?15細胞系的構建方法及其應用。MAP3K8基因敲除的PK?15細胞系PK?15?KO?MAP3K8的保藏編號為CCTCC NO:C2019176。該細胞系的構建方法包括1：根據豬源MAP3K8基因序列分別設計兩條sgRNA，將雙鏈sg RNA與酶切后的lentiGuide?EGFP載體連接得到重組慢病毒表達質粒lentiGuide?EGFP?MAP3K8?sg RNA；2：將重組慢病毒表達質粒、病毒包裝輔助質粒共轉染PK?15細胞；3：收集病毒液，過濾、超速離心濃縮純化病毒；4：用感染復數MOI=30的慢病毒感染PK?15細胞，然后用超速流式細胞分選系統進行單細胞分選；5：將分選得到的單克隆細胞進行擴大培養并測序鑒定。該細胞系能夠促進FMDV和SVV增殖，提高病毒產量，可用于FMDV和SVV疫苗株的大規模細胞化培養和生產，并可為研究MAP3K8在病毒感染過程中的作用機制提供有力工具。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及MAP3K8基因敲除PK-15細胞系的構建方法及其應用。

背景技術

豬腎上皮細胞PK-15，來源于豬腎，中文名為豬腎上皮細胞。該細胞對多種病毒比較敏感，如豬圓環病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)等，可應用于豬圓環病毒疫苗、豬細小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備。

TPL2是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也被稱為COT或MAP3K8，在未受刺激時TPL2與p105和ABIN2形成復合物以保持非活性狀態(Gantke,T.,S.Sriskantharajah,andS.C.Ley,Regulation and function of TPL-2,an IkappaB kinase-regulated MAPkinase kinasekinase.Cell Res,2011.21(1):p.131-45.)。當受到刺激后能通過TLR，TNFR和IL1R等多種受體激活下游ERK、JNK、p38和NF-κB等多種信號轉導途徑；還能刺激巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞等多種先天性免疫細胞產生IFN-γ，TNF-α等大量細胞因子(Gantke T,S.S.,Sadowski M,Ley SC.,IκB kinase regulation of the TPL-2/ERK MAPKpathway.2012.)。TPL2在調節CD4+T細胞分化產生不同Th細胞譜系的過程中也是必不可少的，是先天性免疫、炎癥和腫瘤的重要參與者。

CRISPR-Cas9基因編輯技術是繼ZFN和TALEN技術之后迅速發展起來的第三代基因組編輯技術。該技術來源于細菌和古細菌中存在抵抗噬菌體入侵的CRISPR-Cas獲得性免疫系統，后經人工改造而逐漸發展起來(四川農業大學李沛哲.CRISPR/Cas9技術的發展與應用[N].科學導報,2019-08-20(B02).)。細菌在CRISPR和Cas9的幫助下，可以經由小RNA分子的引導，靶標和沉默入侵者遺傳信息的關鍵部分。CRISPR-Cas9基因組編輯技術是通過一段gRNA特異性識別靶基因序列，并引導Cas9核酸內切酶在靶定位點剪切雙鏈DNA，隨后，細胞的非同源末端連接修復機制(NHEJ)重新連接斷裂處的基因組DNA，并引入插入或缺失突變。與ZFN和TALEN技術相比，CRISPR-Cas9系統的基因編輯效率更高，Cas9系統的載體構建與使用也更加便捷，并已應用在各物種中，是目前使用最廣泛的基因編輯技術。

發明內容

本發明利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8，該細胞系能夠促進口蹄疫病毒(FMDV)和塞尼卡谷病毒(SVV)的增殖，提高病毒產量。可用于FMDV和SVV疫苗株的大規模細胞化培養和生產，并可為研究MAP3K8在病毒感染過程中的作用機制提供有力工具。

第一方面，本發明提供的敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8，其保藏編號為CCTCC NO:C2019176。