[發明專利]MAP3K8基因敲除PK-15細胞系的構建方法及其應用在審
| 申請號： | 201911044827.1 | 申請日： | 2019-10-30 |
| 公開（公告）號： | CN110862968A | 公開（公告）日： | 2020-03-06 |
| 發明（設計）人： | 鄭海學;張克山;閆鳴昊;郝軍紅;田宏;李丹;朱紫祥;茹毅;楊帆;張大俊;劉湘濤 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/867;C12N15/90;C12N15/54;C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111 | 代理人： | 張立強 |
| 地址： | 730046 *** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | map3k8 基因 pk 15 細胞系 構建 方法 及其 應用 | ||
1.敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8，其特征在于，所述PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8的保藏編號為CCTCC NO: C2019176。
2.敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8的構建方法，其特征在于，具體包括如下步驟：
步驟1：引物設計與質粒構建：根據豬源MAP3K8基因序列，分別設計兩條sgRNA，將雙鏈sg RNA與酶切后的lentiGuide-EGFP載體進行連接，得到重組慢病毒表達質粒lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA；
步驟2：質粒轉染：將lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表達質粒、病毒包裝輔助質粒共轉染PK-15細胞；
步驟3：慢病毒濃縮：收集病毒液，過濾、超速離心濃縮純化病毒，保存備用；
步驟4：慢病毒感染及流式分選：用感染復數MOI= 30的慢病毒感染PK-15細胞，然后用超速流式細胞分選系統進行單細胞分選；
步驟5：單克隆細胞的培養及測序鑒定：將分選得到的單克隆細胞進行擴大培養并測序鑒定單細胞克隆。
3.根據權利要求2所述的敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8的構建方法，其特征在于，所述sgRNA的序列為：
P-MAP3K8-sgRNA1 Forward：5’-CACCGTTCCATAATGTCTATTACAT-3’，
P-MAP3K8-sgRNA1Reverse：5’-AAACATGTAATAGACATTATGGAAC-3’；
P-MAP3K8-sgRNA2Forward：5’-CACCGAGATCCCAGATTCCTGGGGT-3’，
P-MAP3K8-sgRNA2Reverse：5’-AAACACCCCAGGAATCTGGGATCTC-3’；步驟1中所述lentiGuide-EGFP載體使用BsmBⅠ酶進行酶切后與sg RNA進行連接。
4.敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8在病毒感染作用機制研究中的應用。
5.根據權利要求4所述的敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8在病毒感染作用機制研究中的應用，其特征在于，所述病毒為FMDV或SVV。
6.敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8在分離和培養FMDV或SVV中的應用。
7.敲除MAP3K8基因的PK-15細胞系PK-15-KO-MAP3K8在FMDV或SVV疫苗株的大規模細胞化培養和生產中的應用。
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