本發明涉及三聚體TRAIL融合蛋白基因修飾間充質干細胞的方法及其用途，所述三聚體TRAIL融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:1。本發明的三聚體TRAIL融合蛋白在分子結構上通過二硫鍵共價結合可形成三螺旋平行盤繞線圈結構域，從而幫助蛋白質折疊成三聚體。因三聚體結構域為共價鍵結合，因此在TRAIL蛋白N末端增加結構域可顯著增強TRAIL三聚體穩定性及抗腫瘤活性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種三聚體TRAIL融合蛋白、利用三聚體TRAIL融合蛋白修飾間充質干細胞的方法和用途。

背景技術

惡性腫瘤作為一種嚴重危害人類健康的疾病，其發病率和致死率逐年升高，然而以手術、放化療等臨床手段不能有效的治療腫瘤，極需尋找其他治療方法。

干細胞作為向腫瘤轉移的基因載體已被廣泛研究，研究發現間充質干細胞在炎性因子和趨化因子的作用下具有專門跟蹤和遷移到體內腫瘤部位的特性，將間充質干細胞作為抗癌藥物的靶向載體，攜帶外源性抑癌因子作用于腫瘤，是目前較為有效的治療手段。

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)可通過激活腫瘤細胞表面促凋亡死亡受體(DRs)4和5，誘導Caspase-8依賴性凋亡，TRAIL可以選擇性靶向腫瘤細胞，誘導癌細胞的凋亡，且對多數正常細胞表現無毒或低毒，具有較強的腫瘤細胞殺傷選擇性，是極具潛力的新型抗腫瘤藥物。研究證實，經可溶性TRAIL基因修飾的臍帶間充質干細胞可以遷移至腫瘤組織周圍，可穩定持續釋放TRAIL，從而抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤凋亡，使模型動物模型的壽命延長，而且其不會影響陰性對照組動物的生存時間。

TRAIL蛋白單體分子具有高度的寡聚化傾向，可形成分子量為48KDa的二聚體和分子量為66KDa的三聚體，其中，三聚體可進一步聚集為六聚體。蛋白的構型穩定性及聚集形式與其腫瘤殺傷活性、受體親和性以及穩定性等有著密切的關系，當TRAIL在空間上形成三聚體結構時，其抗腫瘤活性最佳而穩定性最高。

中國專利公開號：CN107287224A公開了一種分泌TRAIL的間充質干細胞及其治療腦瘤的用途，所述TRAIL重組蛋白由亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈重組基因與TRAIL編碼基因結合，從而提高三聚體TRAIL的穩定性。然而，亮氨酸拉鏈結構是采用疏水相互作用力這種非共價鍵弱相互作用，且Zn原子的存在至關重要。當改變溶液的pH值、離子濃度或增加耦合劑丟失鋅原子后，可能會使蛋白解聚，導致TRAIL蛋白會解聚為二聚體或聚集為六聚體，抗腫瘤活性下降，溶解度降低。

研究發現，肺表面活性蛋白-D(surfactant protein-D，SPD)在分子結構上通過二硫鍵共價結合從而幫助蛋白質折疊成十二聚體。發明專利：CN104160027B公開了一種可表達十二聚體TRAIL及HSV-TK自殺基因的載體及其抗腫瘤作用，所述十二聚體TRAIL即采用SPD結合TRAIL的方法，使TRAIL形成十二聚體。然而，我們在實際應用中發現，雖然十二聚體TRAIL具有良好的殺傷腫瘤作用，但其毒副作用顯著高于三聚體TRAIL或其他低聚體TRAIL(動物安全性評價，未公開)。我們的研究也發現，保留SPD-C端結構域(SPDcc)，可通過共價鍵形成三螺旋平行盤繞線圈結構域(trimeric coiled-coil domain)，從而幫助蛋白折疊成三聚體，顯著增強TRAIL三聚體穩定性，并保持其抗腫瘤活性以及降低肝毒性。

為解決TRAIL蛋白三聚體穩定性的不足，我們利用基因工程手段在體外構建了SPDcc-TRAIL突變體基因，通過病毒載體轉染間充質干細胞，使間充質干細胞高表達可溶性三聚體TRAIL，從而制備抗腫瘤的基因工程干細胞。

發明內容

基于此，有必要針對上述三聚體TRAIL蛋白穩定性差的技術問題，提供一種穩定性好的三聚體TRAIL融合蛋白。

一種三聚體TRAIL融合蛋白，其核酸序列如SEQID NO:1。

在一些實施方式中，所述融合蛋白包括：