本發明提供了可用于在工業相關條件下合成西他列汀中間體的工程化轉氨酶多肽。本發明還提供了編碼工程化轉氨酶多肽的多核苷酸、能夠表達工程化轉氨酶的宿主細胞和使用工程化轉氨酶多肽制備西他列汀中間體的方法。本發明的工程化轉氨酶多肽由來源于Aspergillus fumigatus的野生型轉氨酶經過定向進化的方法所開發而來。與其他制備西他列汀中間體的轉氨酶相比，本發明的工程化轉氨酶多肽具有更佳的活性和/或穩定性，使得酶的制備和轉氨反應的操作更加簡單，因此具有很好的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種制備西他列汀的工程化轉氨酶多肽。

背景技術

糖尿病是由人體自身代謝紊亂引發的一種全身慢性進行性疾病，主要的致病因素是胰島素絕對或相對缺乏。糖尿病還會引發各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙等多種并發癥。糖尿病有四大類型：I型糖尿病、II型糖尿病、其他特殊類型糖尿病和妊娠糖尿病、繼發性糖尿病。其中II型糖尿病(即非胰島素依賴型)占90％以上，多見于30歲以上的中老年人，該類型患者其胰島素分泌量并不低有些甚至還偏高，但機體對胰島素不敏感，因此患者體內的胰島素是一種相對缺乏，可以通過某些口服藥物刺激體內胰島素的分泌。在臨床上治療II型糖尿病的藥物，除了注射胰島素，主要手段是口服人工合成降血糖藥物。目前用于臨床的藥物主要有磺酰脲類--胰島素分泌促進劑、雙胍類--胰島素敏感性增強劑、噻唑烷二酮類--胰島素增敏劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑、非磺酰脲類等。雖然上述藥物降糖作用較為理想，但均有一定的副作用。而新型的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制類藥物西他列汀磷酸鹽的降糖作用較為適中，其單用或與二甲雙胍、吡格列酮合用都有明顯的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反應少。

西他列汀磷酸鹽是由美國默克公司開發的，于2006年10月被美國FDA批準治療II型糖尿病的藥物，商品名為捷諾維(Januvia)。西他列汀磷酸鹽合成中的關鍵步驟是手性氨基中間體的構建。目前公布的合成方法大都需用到催化劑，可以分為金屬催化合成和酶催化合成兩大類。就金屬催化合成法而言，公開的專利包括WO2004087650、WO2005003135、WO2007050485等，所使用的金屬催化劑包括釕、鉑、鈀或銠，這些催化劑價格昂貴，從產品中去除或回收這些金屬催化劑也較為困難；同時，使用金屬催化劑的工藝所生成的手性氨基中間體的手性純度不夠高，需要進一步通過重結晶等方法才能達到藥典的要求。就酶催化合成法而言，公開的文獻有“Biocatalytic Asymmetric Synthesis of Chiral Aminesfrom Ketones Applied to Sitagliptin Manufacture，Science，2010,v329(issue5989),pp.305-309”，專利包括WO2010099501、CN105018440、CN107384887等。這些資料所公開的用來合成手性氨基中間體或西他列汀的酶催化劑均為轉氨酶，且都是在不同野生型轉氨酶的基礎上經過人為的突變和篩選或定向進化過程得到的工程化轉氨酶。公開的資料顯示，由于西他列汀手性氨基中間體的特殊化學結構，自然界中存在的野生型的轉氨酶，要么無法催化該手性氨基中間體的合成反應，要么催化的活性很低，無法用于工業化生產；經過定向進化后得到的工程化轉氨酶，在獲得催化合成該手性氨基中間體的活性的基礎上，需要在穩定性和對反應溶劑的耐受性上也要有所提升(底物水溶性差，需要在酶催化反應中添加有機溶劑)，才能滿足工業化生產對成本和環保方面的要求。相比于金屬催化劑，酶催化合成手性氨基中間體的立體選擇性高，轉氨產物的ee值可達到99％或以上(直接滿足藥典的要求)，且反應條件溫和，目前工業生產上采用人為改造過的轉氨酶來催化西他列汀或其中間體的合成。