本發明公開了一種改良的小鼠門靜脈周肝細胞和中央靜脈周肝細胞分離的方法，利用本發明提供的方法，可快速從小鼠肝臟中分離出大量具有高活力的門靜脈周肝細胞和中央靜脈周肝細胞，所得細胞能保持良好的原代肝細胞形態特征和肝細胞的功能，為門靜脈周、中央靜脈周肝細胞的分離與鑒定，體外研究門靜脈周、中央靜脈周肝細胞代謝差異以及更深層次探索肝細胞異質性的研究提供基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種小鼠門靜脈周肝細胞和中央靜脈周肝細胞的分離方法。

背景技術

肝臟是機體最主要的代謝器官，承載著多種重要的生理功能。傳統意義上，根據門脈三聯管到中央肝靜脈的位置，將肝小葉分為門靜脈周、中間區域和中央靜脈周。在每個肝小葉中，肝細胞因其空間位置不同而被賦予不同的功能。目前對肝臟分區的研究主要包括葡萄糖代謝、氨解毒、藥物和外源性物質代謝等。鑒于PP和PV之間功能的差異，在正常生理情況下，某些基因可以特異性表達，比如E-鈣黏附蛋白(E-Cad)特定表達于PP肝細胞，在PV肝細胞中幾乎不表達；谷氨酸合成酶(Gs)和膽固醇7-羥化酶(Cyp7a1)特定表達于PV肝細胞，在PP肝細胞中幾乎不表達。

在體外研究中，原代肝細胞更能反映出肝臟在機體內的代謝水平，該技術已經被廣泛用于肝臟病理、生物人工肝系統、藥物代謝等研究。隨著肝臟功能研究的不斷深入，肝臟分區也逐步被人關注。目前，關于肝臟細胞分區分離的技術多用于大鼠；而一部分研究者使用顯微切割的方法獲得小鼠PP肝細胞和PV肝細胞，但這種方法會將除實質細胞以外的細胞都分離出來，且細胞損傷嚴重。也有文獻報道小鼠PP肝細胞和PV肝細胞分離方法，但其應用插管技術灌注后續溶液，這對于小鼠這類門靜脈細小的實驗動物來說，操作難度大，持續時間長，難以維持較高的細胞活力。目前沒有關于小鼠門靜脈周和中央靜脈周肝細胞分離方法的專利。因此，我們旨在改良分離方法，為研究肝細胞異質性提供更為便捷有效的技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種小鼠門靜脈周肝細胞和中央靜脈周肝細胞的分離方法，利用本發明提供的方法，可從小鼠肝臟中分離出大量具有高活力的門靜脈周肝細胞或中央靜脈周肝細胞，保持良好的原代肝細胞形態特征和肝細胞的功能。

為達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種小鼠門靜脈周肝細胞和中央靜脈周肝細胞的分離方法，包括下述步驟：

(1)小鼠門靜脈周肝細胞的分離

1)離體灌注機的速度調至30-40rpm/min，將一次性靜脈采血針一端和離體灌注機相連，另一端從小鼠肝臟門靜脈插入；

2)門靜脈周肝細胞分離灌注：打開機器，立即剪斷下腔靜脈，并把離體灌注機的速度調至50-60rpm/min，用36-38℃沖洗液從門靜脈進行灌注，持續灌注直到下腔靜脈處流出的液體顏色澄清；

3)離體灌注機設置為逆流模式，速度為10-15rpm/min，然后使用注射器將損傷劑從下腔靜脈處注射進去，直到肝臟表面出現均勻白色小點，立即將離體灌注機設置為正流模式，速度為40-50rpm/min；

4)繼續灌注20-30mL的沖洗液后，開始灌注36-38℃消化液，速度為40-45rpm/min，直到肝臟膨大并在出現膨大現象后3min之內塌陷下去，此為消化完成；

(2)小鼠中央靜脈周肝細胞的分離

1)離體灌注機的速度調至30-40rpm/min，將一次性靜脈采血針一端和離體灌注機相連，另一端從小鼠肝臟下腔靜脈插入；

2)中央靜脈周肝細胞分離灌注：打開機器，立即剪斷門靜脈，將離體灌注機的速度調至50-60rpm/min，用36-38℃的沖洗液從下腔靜脈進行灌注，持續灌注直到門靜脈處流出的液體顏色澄清；