本發明公開了一種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA。采用同源置換的原理，構建了香蕉枯萎菌Δdcl1、Δdcl2和Δdcl1/2基因缺失突變體，并進行了非生物脅迫測試和致病力分析，結果顯示經過熒光增白劑CFW處理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突變體更加敏感，生長受到抑制，MgCl₂處理后，Δdcl1突變體、Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體的生長均受到抑制。Δdcl1突變體致病力增強，Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體致病力減弱；此外，結合小RNA深度測序獲得各突變體小RNA，為進一步解析香蕉枯萎病的致病機制，開發RNA來源的防控措施等提供理論和技術支撐。

技術領域

本發明涉及一種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA，屬于生物工程技術領域。

背景技術

小RNA，包括miRNA和siRNA，是一類21-24nt長度的小分子非編碼RNA，通過剪切靶標mRNA或轉錄抑制的方式導致序列特異性的轉錄后基因沉默調控，均由類似RNase III的核酸內切酶Dicer(或Dicer類似蛋白)加工產生。Dicer(DCL)作為一種特異性核糖核酸內切酶參與了小RNA生物合成途徑，Dicer的作用機制分兩步：第一步，Dicer與dsRNA結合形成酶-dsRNA復合體，在ATP的作用下將dsRNA解螺旋并將其切割產生5'端磷酸基、3'端羥基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs；第二步，小片段的siRNA與含有PAZ功能域的Argonaute(AGO)蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合體(RNA induced silencing complex,RISC)，該復合體具有序列特異性的核酸內切酶活性，能夠特異性的降解與siRNA同源的靶標mRNA。

真菌也能編碼與植物的miRNA類似的miRNA，命名為microRNA類似小RNAs(microRNA-like RNAs，milRNAs)。milRNAs的生物合成途徑與植物和動物的miRNA生物途徑有很大的差異，粗糙脈孢菌(N.crassa)中發現的milRNAs長度一般是19-25nt，具有發夾卡結構，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能夠特異與Argonaute(AGO)蛋白結合發揮功能。粗糙脈孢菌中有四條不同的milRNAs生物形成途徑，這些milRNAs通過Dicers、QDE-2、核酸外切酶活性的QIP效應蛋白以及具有RNaseⅢ功能域的線粒體核糖體大亞基MRPL3蛋白(mitochondrial ribosomal protein large subunit,MRPL3)的不同組合而產生，其中包括一條不依賴Dicer的milRNA產生途徑(disiRNAs)(Lee et al.,2010)。雖然四種途徑中從基因間隔區轉錄的RNA前體序列長度各異，但都與大多數的植物和動物的miRNA依賴RNAPolymerase II轉錄不同，粗糙脈孢菌的milRNA主要依賴Pol III轉錄的(Yang et al.,2013)。milR-1是粗糙脈孢菌中豐度最高的miRNA-like RNAs，Xue et al.(2012)以milR-1為研究對象構建了依賴AGO的milR-1離體生物形成的生物化學研究框架，研究表明milR-1的加工成熟過程可以分為5個步驟，需要QDE-2、Dicer、QIP以及RNA外來復合體(exosome)的共同參與(Xue et al.,2012)。