[發(fā)明專利]一種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910362380.6 | 申請日： | 2019-04-30 |
| 公開（公告）號： | CN110016519B | 公開（公告）日： | 2020-04-14 |
| 發(fā)明（設計）人： | 彭軍;曾凡云;張欣;漆艷香;謝培蘭;謝藝賢 | 申請（專利權）人： | 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/113;C12R1/645 |
| 代理公司： | 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202 | 代理人： | 陳歡 |
| 地址： | 571101 *** | 國省代碼： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 香蕉 枯萎 生理 dcl 基因 缺失 突變體 及其 rna | ||
1.一種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體，其特征在于，所述香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體為以下3種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體中的任意一種：Δdcl1突變體、Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體；
所述Δdcl1突變體、Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體通過以下方法獲得：
1)Δdcl1突變體的構建方法為：
第一輪PCR擴增：
左端LB：FOC4基因組DNA為模板，DCL1-LBCK和DCL1-HPH-LB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1699bp；
右端RB：以FOC4基因組DNA為模板，DCL1-HPH-RB-F和DCL1-RBCK為引物，擴增產(chǎn)物大小1920bp；
潮霉素抗性基因HPH：載體質(zhì)粒DNA為模板，HYG-F和HYG-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1376bp；
第二輪PCR擴增：
左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH為模板，DCL1-LB-F和HYG-R1為引物，擴增產(chǎn)物大小2310bp；
右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH為模板，HYG-F1和DCL1-RB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小2269bp；
將第二輪PCR片段回收后導入原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，獲得Foc4DCL1基因缺失突變體，即Δdcl1突變體；
其中，DCL1-LBCK、DCL1-HPH-LB-R、DCL1-HPH-RB-F、DCL1-RBCK、DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
2)Δdcl2突變體的構建方法為：
第一輪PCR擴增：
左端LB：FOC4基因組DNA為模板，DCL2-LBCK和DCL2-HPH-LB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1957bp；
右端RB：FOC4基因組DNA為模板，DCL2-HPH-RB-F和DCL2-RBCK為引物，擴增產(chǎn)物大小1837bp；
潮霉素抗性基因HPH：載體質(zhì)粒DNA為模板，HYG-F和HYG-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1376bp；
第二輪PCR擴增：
左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH為模板，DCL2-LB-F和HYG-R1為引物，擴增產(chǎn)物大小2682bp；
右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH為模板，HYG-F1和DCL2-RB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小2103bp；
將第二輪PCR片段回收后導入原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，獲得Foc4DCL2基因缺失突變體，即Δdcl2突變體；
其中，DCL2-LBCK、DCL2-HPH-LB-R、DCL2-HPH-RB-F、DCL2-RBCK、DCL2-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL2-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:20所示；
3)Δdcl1/2突變體的構建方法為：
第一輪PCR擴增：
左端LB：Δdcl1突變體基因組DNA為模板，DCL2-NEO-LBCK和DCL2-NEO-LB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1881bp；
右端RB：FOC4基因組DNA為模板，DCL2-NEO-RB-F和DCL2-NEO-RBCK為引物，擴增產(chǎn)物大小1973bp；
新霉素NEO抗性基因：載體質(zhì)粒DNA為模板，NEO-F和NEO-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1370bp；
第二輪PCR擴增：
左端LB+NE：左端LB和新霉素NEO抗性基因為模板，DCL2-NEO-LB-F和NEO-R1為引物，擴增產(chǎn)物大小2288bp；
右端EO+RB：右端RB和新霉素NEO抗性基因為模板，NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小2412bp；
將第二輪PCR片段回收后導入原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，獲得Foc4DCL1/2雙基因缺失突變體，即Δdcl1/2突變體；
其中，DCL2-NEO-LBCK、DCL2-NEO-LB-R、DCL2-NEO-RB-F、DCL2-NEO-RBCK、DCL2-NEO-LB-F、NEO-R1、NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。
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