[發明專利]一種用于中華鱉遺傳性別鑒定的分子標記及方法有效
| 申請號： | 201910068488.4 | 申請日： | 2019-01-24 |
| 公開（公告）號： | CN109680076B | 公開（公告）日： | 2020-02-07 |
| 發明（設計）人： | 梁宏偉;鄒桂偉;王利華;沙航;孟彥 | 申請（專利權）人： | 中國水產科學研究院長江水產研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12N15/11 |
| 代理公司： | 11401 北京金智普華知識產權代理有限公司 | 代理人： | 楊采良 |
| 地址： | 湖北省武漢市東湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 中華鱉 特異性片段 分子標記 遺傳性別 遺傳性 擴增 生物技術領域 特異性標記 特異性引物 中華鱉裙邊 基因組DNA 雌雄個體 電泳檢測 設計引物 引物篩選 基因組 測序 引物 成功率 驗證 采集 篩選 水產 | ||
1.一種用于中華鱉遺傳性別鑒定方法，其特征在于，所述用于中華鱉遺傳性別鑒定方法包括：
采用RAD技術對中華鱉雌雄個體進行測序，篩選雌雄特異性片段；
根據雌性特異性片段進行雌性基因組Walking，獲得6532bp的特異性片段SEQ ID NO：1；
基于特異性片段設計引物，進行引物篩選和驗證獲得特異性引物組Female1F/Female1R和Female2F/Female2R；
采集中華鱉裙邊組織，保存在無水乙醇中；
提取中華鱉基因組DNA，保存在超純水中；
利用引物組Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中華鱉個體中進行擴增；
擴增結果進行電泳檢測；
進行遺傳性別的鑒定；檢測到特異性條帶的為雌性中華鱉個體，未擴增出特異性條帶的個體為雄性中華鱉；
基于特異性片段設計引物中，引物包括：
引物組1：
Female1F：TGACTGGCACTGGAGAAGGA；
Female1R：GCATCAACCACAGCCCTACA；
引物組2：
Female2F：TCCAGGGCAGAAAGACACTC；
Female2R：ATGTCCCGGTGGATGGC。
2.如權利要求1所述的用于中華鱉遺傳性別鑒定方法，其特征在于，
采用RAD技術對中華鱉雌性和雄性個體進行測序前需進行鑒定樣本的收集；
采用打孔器在中華鱉的裙邊進行打孔，采集雌雄性個體的組織樣本，并保存在無水乙醇中，雌性記為Female，雄性記為Male。
3.如權利要求1所述的用于中華鱉遺傳性別鑒定方法，其特征在于，提取中華鱉基因組DNA包括：
（1）取0.5g左右裙邊組織，用超純水反復沖洗組織表面的無水乙醇，經充分剪碎后放入1.5mL的離心管中；
（2）向離心管中加入10~15μL的蛋白酶K和500μL的HOM buffer，55℃消化4~6h；
（3）加入500μL 4.5M NaCL溶液和300μL的氯仿，充分混勻20min以后，在13000rpm下離心10min；
（4）將上清液轉移到另一個滅菌的新管中，加入600μL無水異丙醇，充分搖勻20min，再13000rpm離心10min；
（5）棄上清液，加入500μL75%乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm離心5min；
（6）棄去上清液，將試管倒立在吸水紙上，室溫下自然干燥；
（7）加100μL超純水溶解DNA，4℃過夜；
（8）用1%的瓊脂糖凝膠進行DNA檢測后，在-20℃下保存備用。
4.如權利要求1所述的用于中華鱉遺傳性別鑒定方法，其特征在于，步驟利用引物組Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中華鱉個體中進行擴增包括：
25 μL PCR 反應體系：10× PCR bu?er mix 2.5 μL， 10 μM 上下游引物0.5 μL， 5U/μL Taq DNA polymerase 0.5 μL， 50 ng/μL DNA模板 1 μL， and 20 μL 超純水；
采用引物組1的PCR 反應過程： 94℃預變性5min，22-24個循環，72℃延伸10min，4℃保存；94℃變性40sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min；
采用引物組2的PCR 反應過程：94℃預變性5min，25-40個循環，72℃延伸10min，4℃保存；94℃變性40sec，62℃退火 30sec，72℃延伸1min。
5.如權利要求1所述的用于中華鱉遺傳性別鑒定方法，其特征在于，擴增結果進行電泳檢測包括：
擴增結束后，取2 μL PCR擴增產物和2 μL 溴酚藍混勻后，在1.5-2.0%的瓊脂糖凝膠上上樣，在最左邊上樣DL2000 marker，120V電壓，電泳30 min關掉電源，然后用凝膠成像系統進行電泳結果的分析。
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