1.一種豬偽狂犬病病毒變異株HN-QYY-gE^-的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：

（1）、將保藏編號為CGMCC No.15192的變異株HN-QYY接種至長滿單層的vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變的時候，收獲病毒液，反復(fù)凍融，離心，取上清，酚氯仿方法提取變異株HN-QYY病毒基因組DNA，保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、以變異株HN-QYY病毒基因組DNA為模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分別PCR擴(kuò)增gE基因上下游同源臂gEL和gER，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化PCR產(chǎn)物，測定DNA含量，保存?zhèn)溆茫?/p>

其中，引物序列分別為：

gEL-f：如SEQ ID No.1所示；gEL-r：如SEQ ID No.2所示；

gER-f：如SEQ ID No.3所示；gER-r：如SEQ ID No.4所示；

（3）、EcoR I和Spe I雙酶切g(shù)EL，Spe I和Hind III雙酶切g(shù)ER，EcoR I和Hind III雙酶切pMD18-T載體，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T；

（4）、將回收后的gEL和gER連接到回收后的pMD18-T上，之后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，菌液PCR篩選陽性克隆，將與陽性克隆相對的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pgE；

（5）、Spe I單酶切質(zhì)粒pgE，純化后去磷酸化，再次純化；

（6）、Nhe I和Spe I雙酶切pEGFP-N1載體，回收酶切后的pEGFP-N1；將回收后的pEGFP-N1連接到去磷酸化后的pgE上，之后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，菌液PCR篩選陽性克隆，將與陽性克隆相對的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pgE-EGFP；

（7）、構(gòu)建重組熒光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺

將步驟（1）所得變異株HN-QYY病毒基因組DNA、pgE-EGFP共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，空斑純化，直至所有細(xì)胞病變均出現(xiàn)綠色熒光，獲得重組熒光病毒HN-QYY-gE^-/EGFP⁺；

（8）、去除綠色熒光基因

將HN-QYY-gE^-/EGFP⁺和pcGlobin2-Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，空斑純化，直至所有細(xì)胞病變均不帶熒光，獲得豬偽狂犬病病毒變異株HN-QYY-gE^-；

豬偽狂犬病病毒變異株HN-QYY-gE^-的保藏編號為：CGMCC No.15200。