本發(fā)明公開了昆蟲內(nèi)共生菌顆粒（以Wolbachia為例）純化、全基因組提取的方法以及利用純化的顆粒進(jìn)行人工轉(zhuǎn)染的方法。通過利用特制的針頭式過濾器，特殊配置的緩沖液改進(jìn)后可以獲得具有活性的昆蟲內(nèi)共生菌顆粒，改進(jìn)昆蟲內(nèi)共生菌顆粒的全基因組提取方法。我們還利用純化方法改進(jìn)了昆蟲內(nèi)共生菌人工轉(zhuǎn)染的方法。可以大幅提高昆蟲共生菌基因組測序成功率，加快我們了解昆蟲內(nèi)共生菌生殖調(diào)控機(jī)理，改進(jìn)后的昆蟲內(nèi)共生菌顆粒純化技術(shù)還極大地縮短我們在昆蟲間建立昆蟲內(nèi)共生菌水平傳播的時間，進(jìn)而加快利用昆蟲內(nèi)共生菌防治害蟲。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種昆蟲內(nèi)共生菌顆粒的純化方法、全基因組提取方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

Wolbachia是一種胞內(nèi)共生菌，其在節(jié)肢動物中更廣泛存在，憑借胞質(zhì)不親和、孤雌生殖、殺雄以及雌性化來調(diào)控昆蟲生殖調(diào)控，在生物防治方面具有廣泛的應(yīng)用。然而，我們?nèi)匀蝗狈@種Wolbachia生殖調(diào)控內(nèi)在分子機(jī)理的理解。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們可以借助高通量技術(shù)實(shí)現(xiàn)對Wolbachia進(jìn)行全基因組進(jìn)行測序，從而從全基因組信息中，探究Wolbachia對昆蟲生殖調(diào)控內(nèi)在分子機(jī)理。然而，高通量測序技術(shù)對Wolbachia樣品的純度有著很高的要求。作為一種胞內(nèi)共生菌Wolbachia不像其它昆蟲體內(nèi)的真菌和細(xì)菌可以進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究人員很難獲得純化的Wolbachia顆粒，也就無法完成Wolbachia全基因組的測序，使我們無法從分子的角度去了解Wolbachia對昆蟲生殖調(diào)控的內(nèi)在分子機(jī)理。我們的發(fā)明，通過建立一種昆蟲內(nèi)共生菌Wolbachia顆粒純化和全基因組提取的方法，為我們理解Wolbachia對昆蟲生殖調(diào)控的內(nèi)在分子機(jī)理提供了手段。

Wolbachia感染超過60％的昆蟲，但是仍然有許多昆蟲自然不感染W(wǎng)olbachia。對于這些自然不感染W(wǎng)olbachia的昆蟲，不能利用Wolbachia的生殖調(diào)控作用對其進(jìn)行生物防治。通過人工轉(zhuǎn)染的方式將Wolbachia轉(zhuǎn)染到新的寄主，就可以利用Wolbachia對這些自然不感染W(wǎng)olbachia的昆蟲進(jìn)行生物防治。由于難以獲得純化的具有活性的Wolbachia顆粒，人工轉(zhuǎn)染的成功率很低，嚴(yán)重妨礙Wolbachia在生物防治方面的應(yīng)用。通過利用上述Wolbachia顆粒純化方法，極大地提高了Wolbachia人工轉(zhuǎn)染的成果率，為未來大量應(yīng)用Wolbachia對害蟲進(jìn)行生物防治提供了技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種昆蟲內(nèi)共生菌顆粒的純化方法。本發(fā)明解決了共生菌Wolbachia全基因組測序過程中，共生菌Wolbachia顆粒純化的問題，并設(shè)計(jì)了共生菌Wolbachia全基因組提取的方法，幫助我們理解昆蟲內(nèi)共生菌Wolbachia對昆蟲生殖調(diào)控內(nèi)在分子機(jī)理，并且為昆蟲間共生菌Wolbachia人工轉(zhuǎn)染進(jìn)行生物防治提供了技術(shù)支持。

技術(shù)方案：為了解決共生菌Wolbachia全基因組測序過程中，共生菌Wolbachia顆粒純化、全基因組測序以及應(yīng)用問題，本發(fā)明提供了一種昆蟲內(nèi)共生菌顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)昆蟲表面漂洗：配制漂洗溶液對昆蟲表面進(jìn)行漂洗；

2)昆蟲組織研磨：將步驟1)漂洗后的昆蟲轉(zhuǎn)入勻漿器，并將緩沖液buffer A轉(zhuǎn)入勻漿器，研磨均勻得到混合物，去除漂浮物及離心取上清液；所述緩沖液buffer A通過蔗糖，磷酸二氫鉀，磷酸一氫鉀，谷氨酸配制而成；

3)上清液的過濾：將上清液采用針頭式過濾器裝置進(jìn)行過濾得到過濾液；

4)收集過濾液，離心去掉上清，即得昆蟲內(nèi)共生菌顆粒。

其中，所述漂洗溶液為梯度配置的次氯酸鈉溶液和/或梯度配置的雙氧水溶液。

其中，所述次氯酸鈉溶液濃度為30％～50％，所述雙氧水溶液濃度為10％～30％，該濃度均為體積百分比濃度。