[發明專利]一種昆蟲內共生菌顆粒的純化方法、全基因組提取方法及應用在審
| 申請號： | 201811570738.6 | 申請日： | 2018-12-21 |
| 公開（公告）號： | CN109439597A | 公開（公告）日： | 2019-03-08 |
| 發明（設計）人： | 鞠佳菲;孫洋;劉寶生;方繼朝;紀銳 | 申請（專利權）人： | 江蘇省農業科學院 |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N15/10;A01K67/033 |
| 代理公司： | 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 王艷 |
| 地址： | 210014 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 共生菌 昆蟲 全基因組 轉染 改進 針頭式過濾器 基因組測序 顆粒純化 生殖調控 水平傳播 緩沖液 配置的 成功率 害蟲 防治 應用 | ||
1.一種昆蟲內共生菌顆粒的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）昆蟲表面漂洗：配制漂洗溶液對昆蟲表面進行漂洗；
2）昆蟲組織研磨：將步驟1）漂洗后的昆蟲轉入勻漿器，并將緩沖液buffer A轉入勻漿器，研磨均勻得到混合物，去除漂浮物及離心取上清液；所述緩沖液buffer A通過蔗糖，磷酸二氫鉀，磷酸一氫鉀，谷氨酸配制而成；
3）上清液的過濾：將步驟2）得到的上清液采用針頭式過濾器裝置進行過濾得到過濾液；
4）收集過濾液，離心去掉上清，即得昆蟲內共生菌顆粒。
2.根據權利要求1所述的一種昆蟲內共生菌顆粒的純化方法，其特征在于，所述漂洗溶液為梯度配置的次氯酸鈉溶液和/或梯度配置的雙氧水溶液。
3.根據權利要求2所述的一種昆蟲內共生菌顆粒的純化方法，其特征在于，所述次氯酸鈉溶液濃度為30%~50%，所述雙氧水溶液濃度為10%~30%。
4.根據權利要求1所述的一種昆蟲內共生菌顆粒的純化方法，其特征在于，所述步驟2）蔗糖濃度為218mmol/L，磷酸二氫鉀濃度為3.8 mmol/L，磷酸一氫鉀濃度為7.2 mmol/L，谷氨酸濃度為4.9 mmol/L。
5.根據權利要求1所述的一種昆蟲內共生菌顆粒的純化方法，其特征在于，所述針頭式過濾器裝置的過濾膜的孔徑為0.22~5μm。
6.一種昆蟲內共生菌顆粒的基因組DNA提取方法，其特征在于，所述提取方法包括權利要求1~4的步驟1）~4），然后還包括以下步驟：
5）利用緩沖液buffer A重新懸浮昆蟲內共生菌顆粒得到懸浮液；
6）在懸浮液中加入DNA酶和RNA酶，去除殘留的DNA和RNA得到溶液；
7）在溶液中加入核酸裂解液，釋放昆蟲內共生菌顆粒的DNA，并加入RNA酶再次去除RNA；
8）步驟7）得到的溶液中加入蛋白沉淀液，去除蛋白質；
9）步驟8）得到的溶液利用酚氯仿異戊醇進行萃取，后利用異丙醇促沉淀；
10）步驟9）得到的溶液離心并利用乙醇清洗，獲得昆蟲內共生菌顆粒的基因組。
7.根據權利要求5所述的昆蟲內共生菌顆粒的基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟6）的DNA酶加入量與懸浮液體積比為1:40，RNA酶加入量與懸浮液體積比為1:100，反應溫度37℃，反應時間30min~1h。
8.根據權利要求5所述的昆蟲內共生菌顆粒的基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟7）核酸裂解液分兩次添加，每次加入300~400μl并吸打數次，保證混合均勻， 37℃水浴時間為90min~120min。
9.根據權利要求5所述的昆蟲內共生菌顆粒的基因組DNA提取方法，其特征在于，所述步驟8）蛋白沉淀液加入量為200~300μl，置于冰上的時間10~15min。
10.利用權利要求1~4所述的昆蟲內共生菌顆粒的純化方法在人工轉染中的應用方法，其特征在于，所述應用方法包括權利要求1~4的步驟1）~4），然后還包括以下步驟：
I）利用緩沖液buffer A重新懸浮昆蟲內共生菌顆粒得到懸浮液；
II）將昆蟲受體研磨后，通過針頭式過濾器裝置過濾，獲得無雜質體液；
III）利用無雜質體液再次懸浮步驟I）獲得的懸浮液；
IV）將步驟III）獲得的懸浮液采用顯微注射進入新的昆蟲體內即建立昆蟲內共生菌穩定感染。
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