[發明專利]一種利用轉谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復合物的方法有效
| 申請號： | 201811293438.8 | 申請日： | 2018-11-01 |
| 公開（公告）號： | CN109517866B | 公開（公告）日： | 2022-04-08 |
| 發明（設計）人： | 楊瑞;劉玉茜;王德生;周中凱 | 申請（專利權）人： | 天津科技大學 |
| 主分類號： | C12P21/02 | 分類號： | C12P21/02;C07K14/79 |
| 代理公司： | 天津盛理知識產權代理有限公司 12209 | 代理人： | 韓曉梅 |
| 地址： | 300457 天津市濱*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 利用 谷氨酰胺 聚糖 制備 鐵蛋白 復合物 方法 | ||
1.一種利用轉谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復合物的方法，其特征在于：步驟如下：
所述方法以紅豆提取的鐵蛋白為原料，利用轉谷氨酰胺酶的催化作用，使殼聚糖結合于鐵蛋白上，通過凝膠過濾方法分離有效的結合組分，即得鐵蛋白-殼聚糖復合物，得到的鐵蛋白-殼聚糖復合物具有相較于鐵蛋白更高的穩定性；
具體步驟如下：
⑴利用紅豆為原料，將紅豆種子置于4℃蒸餾水中浸泡過夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2倍體積含有質量濃度為1％PVP的50mM KH2PO4-Na2HPO4，其pH為7.0，并用內切式勻漿機勻漿3次，每次2-3min，200目濾網濾去豆渣，將收集的勻漿在于6000g、4℃下離心10-15分鐘，棄沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；
⑵向蛋白粗提液中加入終濃度為50-100mM的MgCl2晶體，溶解后立即4500-5000g離心5-10min，棄沉淀，得上清液；上清液靜置20-30min后，加入終濃度為70-100mM的檸檬酸三鈉晶體，靜置6-24h，經10000-12000g離心20-30min后，得沉淀和離心后上清液，沉淀即為紅豆鐵蛋白，該鐵蛋白不復溶于該離心后上清液；
⑶在離心獲得的沉淀中加入其1.5-3倍體積的離心后上清液，沖洗沉淀中的淀粉和核糖體，然后10000g離心5-10min，棄上清，重復1至兩次以上，直至只有褐色沉淀；
⑷將褐色沉淀溶于1.5倍體積蒸餾水中，10000g離心5-10min，棄上清；重復兩次用5倍體積蒸餾水溶解沉淀，13000g離心5-10min，收集并合并上清液，獲得紅豆鐵蛋白，該紅豆鐵蛋白的濃度為1.0-2.0μM，其pH值為6.5-7.0；
⑸向紅豆鐵蛋白中加入轉谷氨酰胺酶及殼聚糖，酶解參數為：酶濃度5000-6000U、殼聚糖及鐵蛋白的終濃度分別為10.0μM及2.0μM、反應時間2-3h、反應pH 6.5-7.0、反應溫度40-45℃，得到粗制的鐵蛋白-殼聚糖復合物；
⑹上述混合物經90-100℃處理3-5分鐘，立即冷卻至25℃，獲得產物經過截留分子量為100-200kDa的透析袋透析，去除未結合的殼聚糖及轉谷氨酰胺酶，并經過0.45μm的濾膜過濾；
⑺上述濾液經過凝膠過濾層析柱分離，其平衡液為50mM MOPS buffer，pH 6.75，100mMNaCl，通過凝膠過濾層析獲得目標產物，即得鐵蛋白-殼聚糖復合物。
2.根據權利要求1所述的利用轉谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復合物的方法，其特征在于：所述紅豆去雜之后置于4℃蒸餾水中浸泡過夜。
3.根據權利要求1所述的利用轉谷氨酰胺酶及殼聚糖制備鐵蛋白-殼聚糖復合物的方法，其特征在于：所述步驟⑺中凝膠過濾層析柱為Sephacryl-300gel凝膠過濾層析柱。
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