本發明公開了一種G2 EPSPS蛋白溶液標準物質定值方法，該方法包括如下步驟：采用同位素稀釋質譜方法以及氨基酸分析法對G2 EPSPS蛋白純品的含量進行準確測定，最后采用重量法?容量法配制出G2 EPSPS蛋白溶液標準物質，以ELISA法進行量值核驗，并進行均勻性和穩定性檢驗，同時進行標準物質加入穩定劑后儲存穩定性驗證。本發明制備的G2 EPSPS蛋白標準物質對于檢測抗草甘膦轉基因作物中G2 EPSPS蛋白是否合理表達至關重要。本發明提供一種G2 EPSPS蛋白溶液標準物質定值方法，具有良好的可靠性、準確性、溯源性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種G2 EPSPS蛋白溶液標準物質定值方法。

背景技術

自1996年以來，抗草甘膦作物已成為最重要的轉基因作物。美國自1998年開始大面積種植抗草甘膦農作物，極大推動了抗草甘膦農作物在全球范圍內的發展，并產生了巨大的經濟效益。但另一方面，轉基因作物花粉攜帶抗草甘膦在環境中漂移，可能導致抗草甘膦基因的擴散而產生超級雜草，造成環境的污染。因此制備G2 EPSPS蛋白標準物質對于檢測抗草甘膦轉基因作物中G2 EPSPS蛋白是否合理表達至關重要。

對抗草甘膦轉基因作物中的G2 EPSPS蛋白進行定量檢測，并保證檢測的準確、可靠和有效性，需要計量標準的支撐。在保證抗草甘膦轉基因作物檢測結果的可比性、溯源性，推進抗草甘膦轉基因作物檢測方法標準化等方面，G2 EPSPS蛋白標準物質發揮著十分重要的作用。本發明提供一種G2 EPSPS蛋白溶液標準物質定值方法，具有良好的可靠性、準確性、溯源性。

發明內容

本發明的目的是提供一種G2 EPSPS蛋白溶液標準物質定值方法。

一種G2 EPSPS蛋白溶液標準物質定值方法，包括如下步驟：

(1)采用兩種精確的蛋白質含量測定方法即同位素稀釋質譜方法和氨基酸分析法對G2 EPSPS蛋白純品進行含量測定；

(2)采用重量法-容量法根據已經進行含量測定的G2 EPSPS蛋白純品配制出G2EPSPS蛋白溶液標準物質，并采用ELISA法進行量值核驗，進行均勻性穩定性檢驗。

(3)配置的標準溶液中加入蛋白穩定劑，以保證蛋白標準物質的穩定儲存

所述步驟(1)中G2 EPSPS蛋白溶液中加入的同濃度標記氨基酸混合溶液包括脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸。加入氨基酸混合液的G2 EPSPS蛋白溶液在(110.0±0.5)℃的烘箱中進行水解，水解不同的時間后上機測定脯氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的相對比例進而確定合適水解時間為48h。另外氨基酸分析法過程中G2 EPSPS蛋白溶液其水解條件與IDMS是相同的，不同的是測定時用國家氨基酸標準物質作為外標，采用柱前衍生化方法進行外標法定量，即分別在G2 EPSPS蛋白質純品水解液中以及苯丙氨酸標準品溶液中加入配置好的衍生劑異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液和三乙胺乙腈溶液在室溫下放置50min左右，衍生結束后加入一定量正己烷溶液，靜置10min，取下層溶液，對衍生后的水解液以及苯丙氨酸標準品溶液進行液相分析。此發明采用同位素稀釋質譜法測定G2 EPSPS蛋白純品純度的同時采用了氨基酸分析法對G2 EPSPS蛋白純品純度進行了測定。

所述步驟(2)中將同位素稀釋質譜方法進行準確含量測定的G2 EPSPS蛋白純品采用重量法-容量法配制出G2 EPSPS蛋白溶液標準物質，并用ELISA法進行量值核驗。

所述步驟(3)中蛋白穩定劑包括1.5％氨基酸，2.5％甘油，0.1％EDTA，0.01％疊氮化鈉。