本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從微生物細(xì)胞中制備谷胱甘肽合成酶系的方法。該谷胱甘肽合成酶系的制備方法包括：(1)將產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系的微生物培養(yǎng)、離心收集細(xì)胞、細(xì)胞破碎；(2)配制聚丙二醇/乳酸鈉雙水相萃取體系溶液；(3)利用雙水相萃取體系進(jìn)行谷胱甘肽合成酶系的分離和純化，得到含有谷胱甘肽合成酶系的乳酸鈉溶液；(4)采用超濾膜過濾濃縮，截留液冷凍干燥，制得谷胱甘肽合成酶系產(chǎn)品。本發(fā)明的聚丙二醇/乳酸鈉雙水相體系對(duì)酶活性具有保護(hù)作用，特別適合谷胱甘肽合成酶系的分離純化；本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽合成酶系制備的連續(xù)化、規(guī)模化，并且酶活力回收率高、純度高，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，谷胱甘肽合成酶系的生產(chǎn)成本較低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從微生物細(xì)胞中制備谷胱甘肽合成酶系的方法。

背景技術(shù)

谷胱甘肽合成酶系由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶組成，該酶系催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽。谷胱甘肽具有清除自由基、解毒、延緩衰老、預(yù)防糖尿病、保護(hù)肝臟、抗輻射、提高人體免疫力、抑制艾滋病病毒、防止皮膚老化等功能，在臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)、食品加工等眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)業(yè)前景，其工業(yè)化生產(chǎn)越來越受到重視.

酶法生產(chǎn)谷胱甘肽具有工藝明確，底物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)，已引起了人們的廣泛關(guān)注。谷胱甘肽合成酶系的制備主要采用微生物發(fā)酵法，即通過培養(yǎng)具有高活性谷胱甘肽合成酶系的微生物如酵母或大腸桿菌等獲得，不同來源的微生物γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子量均不相同，如大腸桿菌E.coli B的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶相對(duì)分子量為55kDa，谷胱甘肽合成酶由4個(gè)亞基組成，相對(duì)分子量為152kDa。谷胱甘肽合成酶系的制備過程包括微生物培養(yǎng)和酶的分離純化。在酶的生產(chǎn)成本構(gòu)成中，分離純化等工序的成本占有相當(dāng)大的比例，因此，如何采用高效的分離技術(shù)是谷胱甘肽合成酶系生產(chǎn)中需要解決的技術(shù)問題。

目前，谷胱甘肽合成酶系的分離純化方法主要有鹽析法、離心法、離子交換法等，如田慧等(生物技術(shù)通報(bào)，2016年11期)在進(jìn)行谷胱甘肽合成酶系制備研究時(shí)，采用60％飽和度硫酸銨沉淀，酶活回收率為93％。上述方法存在酶活力回收率低、純度低、生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、不能連續(xù)生產(chǎn)等問題，從而導(dǎo)致谷胱甘肽合成酶系的生產(chǎn)成本較高。因此，改進(jìn)現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)以及開發(fā)新的生產(chǎn)技術(shù)以降低谷胱甘肽合成酶系的生產(chǎn)成本勢(shì)在必行。

乳酸鈉能與水混溶，常用作水分保持劑、酸度調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑等。研究發(fā)現(xiàn)，聚丙二醇和乳酸鈉兩種物質(zhì)在一定條件下能夠形成一種目前文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道的雙水相體系，該體系對(duì)酶活性具有保護(hù)作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種酶活力回收率高、生產(chǎn)成本低、便于規(guī)模化生產(chǎn)的谷胱甘肽合成酶系的制備方法。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種制備谷胱甘肽合成酶系的方法，包括以下步驟：

(1)將產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系的微生物培養(yǎng)，得細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，制得菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞重懸于去離子水中，制得細(xì)胞質(zhì)量百分比濃度為25～35wt％的溶液，破碎細(xì)胞，得到細(xì)胞破碎液；

(2)在20～30℃下配制乳酸鈉水溶液，將聚丙二醇加入到乳酸鈉溶液中，在總體系中使聚丙二醇的質(zhì)量百分比濃度為20～30wt％、乳酸鈉的質(zhì)量百分比濃度為15～25wt％，混合均勻，制得聚丙二醇/乳酸鈉雙水相體系溶液；

(3)將步驟(1)制得的細(xì)胞破碎液與步驟(2)制得的聚丙二醇/乳酸鈉雙水相體系溶液按體積比(1～2)：1混合均勻，靜置分相，制得乳酸鈉下相溶液和含有谷胱甘肽合成酶系的聚丙二醇上相溶液；

(4)向步驟(3)制得的聚丙二醇上相溶液中加入乳酸鈉，使乳酸鈉在總體系中的質(zhì)量濃度為8～12wt％，混合均勻，靜置分相，制得乳酸鈉下相溶液和含有谷胱甘肽合成酶系的聚丙二醇上相溶液；