本發明公開了一種超靈敏、多殘留檢測晚期糖基化終末產物的方法和應用。所述方法首先制備以金納米線電極為基底電極，并通過巰基乙酸共價偶聯戊糖素的電化學免疫傳感器。基于戊糖素單克隆抗體能與多種晚期糖基化終末產物產生交叉免疫反應，再結合間接競爭法，可實現對包括戊糖素、N(ε)羧甲基賴氨酸、N(ε)羧乙基賴氨酸、丙酮醛咪唑啉酮和精氨嘧啶在內的五種晚期糖基化終末產物的多殘留檢測。本發明提供的檢測方法具有極高的靈敏度(檢測限在0.2～0.4pg/mL之間)和非常寬的線性范圍(0.0004～100ng/mL)。完全適用于臨床上人體AGEs檢測的需要，具有重要的實際應用價值。

技術領域

本發明屬于食品安全檢測和分析化學技術領域，具體涉及一種超靈敏、多殘留檢測晚期糖基化終末產物的方法和應用。

背景技術

晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是在非酶條件下，糖類化合物的醛基或酮基與蛋白質、脂質、氨基酸的自由氨基發生一系列不可逆反應的最終產物。大量研究證明AGEs與糖尿病及其并發癥、尿毒癥、阿爾次海默癥、白內障、原發性骨性關節炎、動脈粥樣硬化病變等疾病的發展過程有著緊密的關聯。因此，AGEs的臨床檢測對于上述疾病的早期診斷和預防具有相當重要的意義和價值。

AGEs的種類繁多，有些甚至尚未確定其結構，目前已知的AGEs有戊糖素(PEN)、N(ε)羧甲基賴氨酸(CML)、N(ε)羧乙基賴氨酸(CEL)、丙酮醛咪唑啉酮(MG)及精氨嘧啶(ARGP)(結構見式1)等。

由于AGEs結構復雜多樣，甚至無確定結構，導致目前臨床上對AGEs的檢測相當困難，甚至無法確定檢測對象。現今能用于檢測AGEs的主要方法有免疫組織化學法、酶免疫吸附試驗法、流動注射分析法等，這些方法通常只能對某一種確定的AGEs進行檢測，使得相關疾病在進行早期診斷時要進行大量重復檢測工作。同時，對于相關疾病的早期診斷來說，發現越早也越容易治療，由于上述AGEs在人體內的積累是連續化的過程，發現更早意味著檢測限必須更低。因此，AGEs的超靈敏、多殘留檢測是進行早期診斷和預防相關疾病的強有效手段。

現今檢測AGEs的方法檢測限基本上能達到ng/mL(ppb)級別，對于更低濃度范圍的檢測則無能為力。金納米線電極因靈敏度高、響應快、檢測限低、傳質速率快等優點，已在單個納米離子檢測、生物活體及單細胞分析等領域得以應用。但到目前為止，基于金納米線電極的AGEs超靈敏檢測技術為零。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種超靈敏、多殘留檢測晚期糖基化終末產物的方法和應用，該方法解決了目前AGEs不存在高效率、多殘留檢測方法的問題，且具有極高的檢測靈敏度和非常寬的線性范圍。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種超靈敏、多殘留檢測晚期糖基化終末產物的方法，包括以下步驟：

步驟1)電化學免疫傳感器的制備：首先將打磨并清洗過的金納米線電極置于巰基乙酸溶液中，使巰基乙酸自組裝于金納米線電極表面；再將其置于N-溴代琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液中，活化羧基；最后置于戊糖素溶液中，通過酰胺鍵的形成使戊糖素共價偶聯于金納米線電極表面，即得到所述的電化學免疫傳感器；

步驟2)標準溶液的配制：配制含有晚期糖基化終末產物的乙醇溶液作為標準溶液，將含有濃度為0的晚期糖基化終末產物的標準溶液作為空白標樣；

步驟3)工作曲線的建立：將步驟1)制備的電化學免疫傳感器浸入含有戊糖素單克隆抗體和步驟2)制備的標準溶液的磷酸緩沖溶液中恒溫孵育，孵育后用磷酸緩沖溶液沖洗電化學免疫傳感器，然后將其置于5mmol/L二茂鐵的乙腈溶液中進行差分脈沖伏安掃描；以孵育前后響應電流變化值ΔI對標準溶液中晚期糖基化終末產物濃度的對數值logC作圖，得ΔI-logC工作曲線，采用線性回歸法獲得ΔI-logC線性回歸方程；