RNA分子是細胞內遺傳信息傳遞系統中重要的一員。現存的標記RNA的方法無法同時具備活細胞、無侵入、高時空分辨率、單分子等特點，需要開發新的標記和追蹤RNA的方法。本發明公開一種基于自連接標簽雙分子熒光互補的新型信使RNA和環狀RNA的標記方法。結合RNA適配子系統，在RNA的合適位置插入適配子，將自連接標簽的兩個部分分別融合RNA適配子的結合蛋白。融合蛋白不結合RNA時，RNA分子不發熒光；當且僅當融合蛋白結合RNA時，RNA分子發出熒光，這樣可以降低細胞內RNA標記的熒光背景。新型自連接標簽雙分子熒光互補的RNA標記方法可以用于活細胞和固定細胞的信使RNA和環狀RNA的長時程無干擾單分子成像觀測和追蹤，在細胞生物學中具有非常廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種新的細胞內信使RNA和環狀RNA標記方法，及其在細胞生物學中的應用。屬于細胞生物學領域。

背景技術

核糖核酸(RNA)分子是存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息的傳遞體。一個核糖核苷酸單體分子由一分子磷酸，核糖和堿基構成。核糖核苷酸單體的堿基主要有4種，即腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)。RNA是由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成的長鏈狀高分子聚合物。中心法則指出，DNA通過轉錄形成RNA，RNA翻譯成蛋白質發揮功能。RNA是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現遺傳信息從DNA到蛋白質的轉移，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁。RNA種類繁多，包括但不局限于信使RNA(mRNA)，核糖體RNA(rRNA)和轉運RNA(tRNA)。近年來發現的很多種類的其他RNA在細胞的生命活動中也扮演著非常重要的角色，包括長非編碼RNA，eRNA，環狀RNA等。

近幾十年來，顯微鏡和RNA標記技術的進步使得RNA分子的成像成為可能。在固定細胞和活細胞中對RNA分子的直接標記能幫助我們獲得RNA分子的數量、位置、動態等信息，提供RNA代謝過程的動力學，包括RNA的轉錄、轉運、修飾、翻譯、降解等。最常用的RNA標記方法是在固定細胞中的針對RNA序列的熒光原位雜交，這是定位RNA分子的金標準方法。在一條RNA上設計多達幾十個互補配對的探針可以增大信號，提高信噪比，能將RNA的定位提高到單分子水平。同時熒光原位雜交還允許多色高通量同時標記定位多種類RNA。但是熒光原位雜交的最大缺點是不能兼容活細胞，需要將細胞固定打孔才能把熒光標記的探針送入細胞中，所以只能得到RNA的位置信息，而缺乏動態信息。而活細胞內的RNA成像技術可以提供RNA動態表達過程的實時數據。活細胞的標記方法主要包括分子信標，RNA適配子系統，可編輯的RNA識別蛋白。分子信標一般是短的DNA分子，兩端各連接一個熒光染料基團和淬滅基團。不結合到RNA上時，DNA分子內部可以形成配對的結構而使熒光染料淬滅不發光。結合到RNA上時打開內部結構，使RNA發光。然而，這些探針不能自主進入活細胞，需要使用顯微注射等侵入性方法使探針進入細胞，這將會對細胞正常的生理活動產生一定的傷害。RNA適配子系統是在待標記的RNA的非編碼區插入一段RNA適配子，共表達RNA適配子結合蛋白或者加入透膜結合染料可以實現RNA的非侵入性標記。當在RNA的非編碼區插入多重適配子后，就可以實現RNA的單分子標記。這種方法是目前活細胞中RNA標記最常用的方法。但是插入多個適配子后會影響RNA的本身的代謝過程，阻礙RNA的運輸。基于可編輯的RNA結合蛋白標記RNA分子的原理是通過調整蛋白質或者sgRNA的序列，可以對內源性不加任何標簽的RNA進行標記。但該方法無法實現單分子標記，同時由于可編輯的RNA結合蛋白一般比較大，可能會影響RNA的運輸過程。