本發(fā)明公開了一種簡單高效測定β?淀粉酶活力的方法，屬于淀粉酶領(lǐng)域。β?淀粉酶活力的測定方法有DNS試劑顯色法和對硝基苯酚麥芽戊糖苷法。DNS法耗時(shí)長、靈敏度低，其測定的β?淀粉酶活力值會(huì)受到α?淀粉酶的影響，而對硝基苯酚麥芽戊糖苷法簡便快速，靈敏度高，但是只能表示β?淀粉酶的相對酶活。因此，本發(fā)明通過將DNS試劑顯色法和對硝基苯酚麥芽戊糖苷法進(jìn)行線性擬合，結(jié)合兩者的優(yōu)勢，建立了一種操作簡單、靈敏度高的可測定β?淀粉酶絕對酶活值的β?淀粉酶活力測定方法。采用該方法可以簡單快速地測定出無論是純化β?淀粉酶還是β?淀粉酶酶制劑混合物中β?淀粉酶的絕對酶活值，初步應(yīng)用結(jié)果顯示該優(yōu)化方法結(jié)果也較為準(zhǔn)確，可以進(jìn)一步推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種簡單高效測定β-淀粉酶活力的方法，屬于淀粉酶領(lǐng)域。

背景技術(shù)

β-淀粉酶，又稱麥芽糖苷酶，是一種外切型糖化酶。它能從淀粉的非還原性末端開始依次切開間隔的α-1,4糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是麥芽糖和β-極限糊精。β-淀粉酶廣泛應(yīng)用于啤酒釀造、食品加工等行業(yè)，是一種重要的工業(yè)用酶。目前β-淀粉酶酶活的測定方法有DNS試劑顯色法和對硝基苯酚麥芽戊糖苷試劑盒法。

DNS法主要是通過測定酶解產(chǎn)物中的還原糖含量來確定β-淀粉酶的活性，是使用最為廣泛的β-淀粉酶酶活測定方法。然而，由于植物中提取的粗酶液和某些微生物表達(dá)的β-淀粉酶中可能混有其他的淀粉水解酶類(特別是α-淀粉酶)，在此情況下由還原糖含量表示的酶活值并不準(zhǔn)確，因此準(zhǔn)確測定粗酶液中β-淀粉酶的絕對酶活存在一定困難。且DNS法靈敏度低、耗時(shí)、試劑具有一定的毒性，因此比較適用于純化后β-淀粉酶酶活的測定。

對硝基苯酚麥芽戊糖苷試劑盒法以β-淀粉酶的專一性底物對硝基苯酚麥芽戊糖苷作為底物，β-淀粉酶與其反應(yīng)釋放一分子麥芽糖和對硝基苯酚麥芽三糖從而確定酶活力，專一性較高，且方法快速、靈敏、操作簡便，但是其酶活單位是以單位時(shí)間內(nèi)釋放的對硝基苯酚麥芽戊糖苷的量來計(jì)量的，通常用β-淀粉酶的相對酶活來表示，具有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是既操作簡單，又能準(zhǔn)確測定淀粉酶粗酶液β-淀粉酶的絕對酶活，為了解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)將DNS測定法與對硝基苯酚麥芽戊糖苷試劑盒法進(jìn)行結(jié)合，旨在建立一種準(zhǔn)確、簡便的測定粗酶液中β-淀粉酶絕對酶活值的方法。

本發(fā)明的目的是提供一種測定β-淀粉酶活力的方法，所述方法是聯(lián)合采用對硝基苯酚麥芽戊糖苷法和DNS法測定待測樣品中β-淀粉酶活力。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法中待測樣品中β-淀粉酶的濃度為12-60μg/mL。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法中線性擬合曲線回歸方程為y＝0.0079x+0.0089， R²值為0.9886。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體是：

(1)采用純化的β-淀粉酶稀釋為不同濃度，分別采用對硝基苯酚麥芽戊糖苷法和DNS 法測定反應(yīng)后的吸光值；

(2)將對硝基苯酚麥芽戊糖苷法和DNS法測定的吸光值進(jìn)行相關(guān)性分析，確定線性濃度范圍；

(3)將純化的β-淀粉酶稀釋至步驟(2)的線性濃度范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，建立線性擬合曲線回歸方程y＝0.0079x+0.0089，R²值為0.9886；

(4)將待測樣品采用對硝基苯酚麥芽戊糖苷法和DNS法進(jìn)行測定，利用回歸方程計(jì)算β-淀粉酶活力。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述對硝基苯酚麥芽戊糖苷法具體為：取10～30μL酶液與專一性底物對硝基苯酚麥芽戊糖溶液一同置于50～60℃下保溫2～4min后混合，50～60℃下反應(yīng)10～15min，加入200～400μL終止緩沖液，取反應(yīng)液測定400nm處的吸光值。