本公開提供了用于使用條碼化的片段從頭組裝基因組DNA的方法。

相關(guān)申請數(shù)據(jù)

本申請要求于2016年8月10日提交的美國臨時申請?zhí)?2/373,057號的優(yōu)先權(quán)，其通過引用納入本文用于所有目的。

政府權(quán)益的聲明

本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)的5DP1CA186693下于政府資助下完成。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。

背景技術(shù)

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明的實施方式通常涉及用于由單個細(xì)胞從頭組裝基因組核酸(如DNA)的方法和組合物。

背景技術(shù)

基因組從頭組裝是在沒有參照序列的幫助下將單個短測序讀數(shù)組裝成較長序列的過程。當(dāng)前，大多數(shù)的高通量測序產(chǎn)生僅幾百個堿基對的序列長度。然后，通過確定這些片段在何處重疊，將這些短片段重建在一起。然而，在復(fù)雜的生物體，例如人類的基因組中存在許多重復(fù)序列。許多這些重復(fù)區(qū)域長于DNA測序儀的讀數(shù)長度，這使得組裝沒有缺口的全基因組十分困難。

在細(xì)胞間變異和種群異質(zhì)性起關(guān)鍵作用的研究中，如腫瘤生長、干細(xì)胞重編程、胚胎發(fā)育等，進行單個細(xì)胞基因組測序的能力非常重要。當(dāng)進行測序的細(xì)胞樣品非常珍貴或稀有或以微量存在時，單個細(xì)胞基因組測序也同樣非常重要。準(zhǔn)確的單個細(xì)胞基因組測序的重要之處在于基因組DNA(可以是處于微量的)的初始擴增。

擴增和測序后的基因組從頭組裝是用于全基因組測序的許多方法的一個重要方面。全基因組擴增方法包括多重置換擴增(MDA)，其是在測序和其它分析之前在采用來自單個細(xì)胞的基因組DNA的領(lǐng)域的常用方法。在該方法中，隨機引物退火后，利用具有強鏈置換活性的DNA聚合酶進行延伸。來自單個細(xì)胞的原始基因組DNA以級聯(lián)樣的形式指數(shù)地擴增，以形成超支化DNA結(jié)構(gòu)。擴增來自單個細(xì)胞的基因組DNA的其它方法述于Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,和Xie,X.S.(2012),單個人細(xì)胞的單核苷酸和拷貝數(shù)變異的基因組范圍檢測(Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of asingle human cell),Science 338,1622-1626，其中描述了多重退火和基于環(huán)型的擴增循環(huán)(MALBAC)。本領(lǐng)域所知的另一方法是簡并寡核苷酸引物PCR或DOP-PCR。用于單個細(xì)胞基因組DNA的若干其他方法包括：Cheung,V.G.和S.F.Nelson,使用簡并寡核苷酸的全基因組擴增允許成百上千個基因型以少于一納克的基因組DNA進行(Whole genomeamplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds ofgenotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA),Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,1996.93(25):14676-9頁；Telenius,H.,等,簡并寡核苷酸引發(fā)的PCR：通過單個簡并引物的常規(guī)擴增(Degenerate oligonucleotide-primed PCR:general amplificationof target DNA by a single degenerate primer),Genomics,1992.13(3):718-25頁；Zhang,L.,等,單個細(xì)胞的全基因組擴增：對基因分析的啟示(Whole genomeamplification from a single cell:implications for genetic analysis).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,1992,89(13):5847-51頁；Lao,K.,N.L.Xu,和N.A.Straus,使用單個引物的PCR的全基因組擴增(Whole genome amplification using single-primer PCR),Biotechnology Journal,2008,3(3):378-82頁；Dean,F.B.,等,使用多重置換擴增的完整人基因組擴增(Comprehensive human genome amplification using multipledisplacement amplification),Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,2002.99(8):5261-6頁；Lage,J.M.,等,使用超支化鏈置換擴增和列陣-CGH對小DNA樣品中基因變異的全基因組分析(Whole genome analysisof genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched stranddisplacement amplification and array-CGH),Genome Research,2003,13(2):294-307頁；Spits,C.,等,單個細(xì)胞全基因組置換擴增的優(yōu)化和評價(Optimization andevaluation of single-cell whole-genome multiple displacement amplification),Human Mutation,2006,27(5):496-503頁；Gole,J.,等,使用納米微微管進行單個細(xì)胞大規(guī)模平行聚合酶克隆和基因組測序(Massively parallel polymerase cloning and genomesequencing of single cells using nanoliter microwells),Nature Biotechnology,2013.31(12):1126-32頁；Jiang,Z.,等,使用多重置換擴增的單個精子的基因組擴增(Genome amplification of single sperm using multiple displacementamplification),Nucleic Acids Research,2005,33(10):e91頁；Wang,J.,等,靜止細(xì)胞中重組活性和新生突變比例的基因組范圍單個細(xì)胞分析(Genome-wide Single-CellAnalysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in HumanSperm),Cell,2012.150(2):402-12頁；Ni,X.,肺癌患者單循環(huán)腫瘤細(xì)胞中可再生拷貝數(shù)變異模式(Reproducible copy number variation patterns among single circulatingtumor cells of lung cancer patients),PNAS,2013,110,21082-21088；Navin,N.,通過細(xì)胞測序推測腫瘤進化(Tumor evolution inferred by single cell sequencing),Nature,2011,472(7341):90-94；Evrony,G.D.,等,人大腦中11個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座和體細(xì)胞突變的單個神經(jīng)元測序分析(Single-neuron sequencing analysis of l1retrotransposition and somatic mutation in the human brain),Cell,2012.151(3):483-96頁；和McLean,J.S.,等,使用高通量單個細(xì)胞基因組學(xué)平臺從醫(yī)院槽中的生物膜中回收牙齦卟啉單胞菌病原體的基因組(Genome of the pathogen Porphyromonasgingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using a high-throughput single-cell genomics platform),Genome Research,2013.23(5):867-77頁。涉及全基因組擴增方面的方法報道于WO 2012/166425，US 7,718,403，US 2003/0108870和US 7,402,386。