本發明提供了一種檢測基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括：a)帶有第一檢測標記的突變區探針，所述突變區探針能與基因的熱點突變區域的突變序列雜交；b)帶有第二檢測標記的突變區野生型探針，所述突變區野生型探針能與基因的突變區域野生型序列雜交。通過使用該試劑盒獲得所述第一檢測標記的第一信號和所述第二檢測標記的第二信號，計算突變基因的拷貝數和突變頻率，確定所述基因的熱點突變區域中是否存在突變。

技術領域

本發明涉及檢測基因突變的試劑盒及其方法，特別涉及檢測在基因的熱點突變區域的基因突變。

背景技術

突變基因的檢測對于臨床用藥及個性化治療均具有重要的指導意義。約70％的乳腺癌為雌激素受體(Oestrogen recreptorα，ER)表達陽性，常規治療使用內分泌療法。然而，約25％的原發性乳腺癌和幾乎所有轉移性乳腺癌的病人具有或最終發展出內分泌抵抗。內分泌抵抗的病人使用它莫西芬或芳香酶抑制藥等內分泌療法進行治療是無效的。近期臨床實驗數據顯示，基因ESR1(編碼ER的基因)激活突變是乳腺癌產生內分泌抵抗的一個重要原因，這些突變集中在ESR1上的配體結合區域。因此，乳腺癌患者檢測ESR1基因的突變狀態對是否使用內分泌療法和病程監控具有關鍵的指導意義。

對腫瘤患者檢測的金標準是使用從腫瘤組織中抽提的DNA進行檢測。鑒于部分病人腫瘤組織很難獲得，比如乳腺癌病人發現較晚不適合進行手術切除或組織活檢，以及在治療過程中需要多次取樣進行病程監控，血液中的循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是進行ESR1突變檢測的另一個樣本來源。由于ctDNA在血液中含量極低，使用常規PCR方法不再能夠檢測到。微滴數字PCR平臺(Droplet digital PCR，ddPCR)是基于PCR技術的第三代檢測方法，采用一種全新的方式對核酸分子進行絕對定量，與傳統PCR、定量PCR相比，具有更高的精確度、準確度和靈敏性。ddPCR定量的結果不再依賴于Ct值，實現真正意義上的絕對定量。

發明內容

本發明提供了一種試劑盒，包括：

a)帶有第一檢測標記的突變型探針，所述突變型探針能與基因的突變區域雜交；

b)帶有第二檢測標記的突變區野生型探針，所述突變區野生型探針能與基因的突變區域野生型序列雜交；和

c)說明書，所述說明書提供了檢測所述基因的熱點突變區域中是否存在突變的說明，其中通過對樣本進行數字PCR擴增，用所述第一檢測標記的第一信號和所述第二檢測標記的第二信號計算突變基因的拷貝數；

其中所述目的基因為ESR1基因，所述熱點突變選自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一個或多個。

在一個實施例中，所述E380Q的突變型探針序列如SEQ ID NO:1所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:12所示；所述V392I的突變型探針序列如SEQ ID NO:2所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:13所示；所述V534E的突變型探針序列如SEQ ID NO:4所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:15所示；所述P535H的突變型探針序列如SEQID NO:5所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:16所示；所述L536R的突變型探針序列如SEQ ID NO:6所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:16所示；所述L536Q的突變型探針序列如SEQ ID NO:7所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:16所示；所述Y537C的突變型探針序列如SEQ ID NO:8所示，其突變區野生型探針序列為SEQ ID NO:17所示。

在一個具體實施例中，所述試劑盒還包括一種或多種選自下組的試劑：

a)DNA聚合酶；b)核苷酸單體混合物；和c)能夠擴增含有所述突變位點模板序列的一對引物。