本發明提供了一種截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信號蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信號蛋白序列和所述穿膜肽序列通過連接肽連接。本發明還提供了制備融合蛋白的方法，包括：制備質粒、轉化、多拷貝插入重組子的篩選、發酵和純化。本發明還提供了融合蛋白的編碼基因，包含該編碼基因的表達載體、細胞系。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白及其制備方法，本發明還涉及所述融合蛋白的編碼基因。

背景技術

刺鼠信號蛋白(Agouti signaling protein,ASIP)由Agouti基因編碼,不同物種的Agouti基因及刺鼠信號蛋白有較高的同源性。Agouti基因編碼的刺鼠信號蛋白由131個氨基酸構成，包含N端22個氨基酸殘基的信號肽和109個氨基酸殘基的功能區。

1994年Lu等發現刺鼠相關蛋白(ASIP)與黑皮素受體(MCR)有高度的親和力，ASIP與α-促黑素(MSH)競爭性和黑皮素受體-1(MC1R)結合，阻滯α-MSH下游的信號傳導進而抑制黑素合成。體外黑素細胞培養實驗也證實，加入ASIP可拮抗α-MSH，抑制黑素細胞內的cAMP水平升高、抑制酪氨酸酶TRP-1和TRP-2的表達，使黑素細胞合成黑素降低。也有實驗表明ASIP在自體移植皮片中能競爭性拮抗α-MSH的黑素合成，使皮片著色能力降低，從而證明皮片移植后表皮細胞中α-MSH的表達上調是皮片呈過度色素沉著的重要原因。從而可以得出結論，ASIP對皮膚顏色的影響主要是通過抑制黑素的合成實現的。

刺鼠信號蛋白具有顯著的抑制黑色素生成的活性，在皮膚色素沉著中具有很好的應用潛力，但目前還未見到重組刺鼠信號蛋白表達及應用的報道。

發明內容

本發明的發明目的在于提供一種截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白及其制備方法與編碼基因。

一方面，本發明提供了一種截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信號蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信號蛋白序列和所述穿膜肽序列通過連接肽連接。

另一方面，本發明提供了前述融合蛋白的制備方法，包括：

(1)制備質粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:4的核苷酸序列，對pPIC9K載體及SEQ ID No:4的核苷酸序列進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，并轉化大腸桿菌，提取質粒；

(2)轉化：將步驟(1)制備的質粒轉化畢赤酵母感受態細胞，獲得轉化后菌落；

(3)多拷貝插入重組子的篩選：將步驟(2)轉化后的菌落進行進一步篩選，獲得轉化子；

(4)發酵：對步驟(3)獲得的轉化子進行發酵培養獲得發酵液；

(5)純化：將步驟(4)得到的發酵液依次進行固液分離、過濾、濃縮和離子交換層析得到產品。

另一方面，本發明提供了前述融合蛋白的編碼基因。

另一方面，本發明提供了含有前述編碼基因的表達載體。

另一方面，本發明提供了含有前述編碼基因的細胞系。

另一方面，本發明提供了前述融合蛋白在制備藥品中的應用。

另一方面，本發明提供了前述融合蛋白在制備化妝品中的應用。

本發明的截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白中的截短型人刺鼠信號蛋白是對天然刺鼠信號蛋白的剪切，選取C端的50個氨基酸，但其仍具有抑制黑色素生成活性；同時在截短型刺鼠信號蛋白的N端添加了細胞穿膜肽，以便于在色素沉著皮膚中的應用時透過皮膚屏障。

附圖說明